豬源TTV轉(zhuǎn)錄本的鑒定及熒光定量PCR檢測(cè)方法的建立.pdf

1、TTV(Torque teno virus)屬于環(huán)病毒科指環(huán)病毒屬成員,為單股、環(huán)狀、負(fù)鏈的DNA病毒,正20面體對(duì)稱結(jié)構(gòu),無(wú)囊膜。人源TTV基因組大小約為3900bp,豬源TTV約2700bp。到目前為止,尚未發(fā)現(xiàn)豬源TTV與任何一種豬病有必然聯(lián)系,但是與一些豬病的發(fā)生有一定的相關(guān)性,如斷奶豬多系統(tǒng)衰竭綜合癥、豬皮炎腎炎綜合癥等,因此,研究豬源TTV對(duì)于預(yù)防其潛在的致病性有重要意義。
　　 1、由于還沒(méi)有找到適合在體外培養(yǎng)TT

2、V的細(xì)胞系,其基因組結(jié)構(gòu)及復(fù)制轉(zhuǎn)錄機(jī)制尚不清楚。本研究利用本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建的含有TTV2基因組三種不同拷貝數(shù)的質(zhì)粒pSK+1TTV2(含有1個(gè)TTV2基因組拷貝的pSK載體)、pSK+1.3TTV2(含有1.3個(gè)TTV2基因組拷貝的pSK載體)、pSK+2TTV2(含有2個(gè)TTV2基因組拷貝的pSK載體),將其轉(zhuǎn)染至張氏肝細(xì)胞,48小時(shí)后,提取總的RNA,用DpnⅠ消化其中可能存在的DNA,然后利用預(yù)測(cè)的閱讀框ORF1、ORF2、ORF3的

3、擴(kuò)增引物,確證其中的DNA已經(jīng)消除干凈。RNA經(jīng)反轉(zhuǎn)錄后,用這三對(duì)引物擴(kuò)增目的基因片段,經(jīng)克隆和測(cè)序,結(jié)果發(fā)現(xiàn):ORF1確實(shí)發(fā)生了轉(zhuǎn)錄,但轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物并非ORF1全長(zhǎng)序列,而是在TTV2基因組的1020nt至1706nt處發(fā)生了687個(gè)堿基的剪切,剪接后的mRNA編碼區(qū)序列全長(zhǎng)為1188bp,這是之前沒(méi)有預(yù)測(cè)到的；由于ORF2被包含在ORF3之中,因此,我們盡管擴(kuò)增出了條帶,但仍不能確定其是否發(fā)生了轉(zhuǎn)錄,然而,通過(guò)序列比對(duì)發(fā)現(xiàn),這個(gè)可能轉(zhuǎn)錄

4、的閱讀框并沒(méi)有發(fā)生剪切；ORF3確實(shí)存在,而且通過(guò)序列比對(duì)發(fā)現(xiàn),ORF3確實(shí)像被預(yù)測(cè)的那樣是由兩個(gè)基因片段剪接而來(lái)的,這兩個(gè)基因片段分別位于TTV2基因組的393nt-595nt和1934nt-2330nt上,ORF3的全長(zhǎng)序列大小為600bp；ORF3在被預(yù)測(cè)的剪接方式的基礎(chǔ)上又進(jìn)一步發(fā)生了兩種形式的剪接,一種剪接發(fā)生在TTV2基因組的2048nt-2118nt處,剪切了71bp,剪接后的mRNA編碼區(qū)序列全長(zhǎng)為529bp,另一種剪接

5、發(fā)生在TTV2基因組的2048nt-2138nt處,剪切了91bp,剪接后的mRNA編碼區(qū)序列全長(zhǎng)為509bp,從而產(chǎn)生了兩個(gè)新的閱讀框,我們將前一種剪接方式產(chǎn)生的閱讀框稱為ORF4,將后一種剪接方式產(chǎn)生的閱讀框稱為ORF5。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn),ORF3、ORF4、ORF5的剪接方式皆完全符合GT-AG規(guī)則,而OR目的剪接并沒(méi)有按照這一規(guī)則進(jìn)行。
　　 2、分別在TTV1和TTV2的UTR區(qū)域找出一段既高度保守又高度特異的核苷酸序列

6、,大小分別為137bp和139bp,將兩片段核苷酸序列克隆至pMD18-T載體上,分別轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)細(xì)胞,擴(kuò)增后提取質(zhì)粒,制備陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)品。分別在TTV1和TTV2的上述區(qū)域設(shè)計(jì)引物和TaqMan探針。經(jīng)優(yōu)化反應(yīng)條件,繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,分別建立了針對(duì)TTV1和TTV2的熒光定量PCR檢測(cè)方法。TTV1標(biāo)準(zhǔn)曲線的相關(guān)系數(shù)為0.984,TTV2標(biāo)準(zhǔn)曲線的相關(guān)系數(shù)為0.994。此兩種方法的最低檢出量均可達(dá)10copies／μL,除豬源TTV外

7、,對(duì)豬繁殖與呼吸綜合征病毒、豬瘟病毒、豬2型圓環(huán)病毒、豬流感病毒檢測(cè)結(jié)果均為陰性,批內(nèi)和批間重復(fù)性試驗(yàn)變異系數(shù)均小于3％。利用建立起來(lái)的兩種熒光定量PCR檢測(cè)方法檢測(cè)采集自廣西和內(nèi)蒙古的44份病料,結(jié)果顯示,TTV1的陽(yáng)性率為47.73％,TTV2陽(yáng)性率為70.45％,TTV1和TTV2混合感染的陽(yáng)性率為31.82％。病料中TTV1 DNA含量一般在105 copies／g-108 copies／g之間,TTV2 DNA含量一般在106

8、copies／g-107copies／g之間。豬源TTV檢測(cè)方法的建立為該病毒的流行病學(xué)調(diào)查和定量提供了有效的手段。
　　 3、本研究將OR目的表位富集區(qū)(ORF1a)和ORF2全長(zhǎng)分別克隆到pColdTMI DNA載體上,重組質(zhì)粒在BL21(DE3)pLysS細(xì)胞中高效表達(dá)。其中,ORF1a表達(dá)出包涵體形式的重組蛋白,菌體經(jīng)超聲波破碎和包涵體洗滌液純化后獲得了高純度的純化蛋白。而ORF2表達(dá)的可溶性重組蛋白利用鎳離子親和柱純化