酒明串珠菌不對(duì)稱(chēng)合成手性醇及其反Prelog脫氫酶的酶學(xué)特性研究.pdf

1、光學(xué)純的手性醇是化學(xué)合成中廣泛應(yīng)用的重要手性砌塊,其中(R)-和(S)-2-辛醇是合成類(lèi)固醇、昆蟲(chóng)性外激素(生物殺蟲(chóng)劑)等光學(xué)活性藥物和農(nóng)藥的中間體,特別是制備高性能液晶及液晶組件不可或缺的原料。利用微生物醇脫氫酶(ADH)對(duì)潛手性酮進(jìn)行不對(duì)稱(chēng)還原制備單一對(duì)映體的手性醇是當(dāng)前手性合成的研究熱點(diǎn),因其具有立體選擇性好、理論產(chǎn)率高(100％)、環(huán)境友好等的特點(diǎn)。論文以本研究室篩選到的一株不對(duì)稱(chēng)還原2-辛酮生成(R)-2-辛醇的酒明串珠菌Oe

2、nococcus oeni CECT4730為基礎(chǔ),著眼于工業(yè)化生產(chǎn),以時(shí)空產(chǎn)率為目標(biāo),采用原位分離技術(shù)構(gòu)建了新的水/有機(jī)溶劑兩相反應(yīng)系統(tǒng),對(duì)全細(xì)胞不對(duì)稱(chēng)制備(R)-2-辛醇進(jìn)行研究,并對(duì)O.oeni CECT4730中起關(guān)鍵催化作用的反Prelog規(guī)則(R)-ADH進(jìn)行了分離純化和酶學(xué)性質(zhì)研究。主要工作及取得的結(jié)論如下:
　　 (1)通過(guò)比較酒明串珠菌O.oeni CECT4730在6中常見(jiàn)明串珠菌培養(yǎng)基上生長(zhǎng)和產(chǎn)(R)-AD

3、H的情況,發(fā)現(xiàn)ATB培養(yǎng)基為最適的發(fā)酵培養(yǎng)基類(lèi)型。通過(guò)Plackett-Burman試驗(yàn)選出ATB中對(duì)該菌發(fā)酵產(chǎn)酶具有顯著正效應(yīng)的3個(gè)因素,按其重要性依次為:番茄汁、酵母膏、檸檬酸氫二銨。并且發(fā)現(xiàn)ATB培養(yǎng)基中番茄汁濃度較高時(shí),其對(duì)O.oeniCECT4730發(fā)酵產(chǎn)(R)-ADH的促進(jìn)作用比對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的促進(jìn)作用更為明顯。通過(guò)響應(yīng)面分析確定了各顯著性影響因素的最優(yōu)水平,從而確定了O.oeni CECT4730發(fā)酵培養(yǎng)基的最適配方為:葡萄糖

4、1％、蛋白胨1％、鹽酸-L-半胱氨酸0.05％、MgSO4·7H2O0.02％、MnSO4·4H2O0.005％、吐溫800.1％、番茄汁23.8％、酵母膏0.52％、檸檬酸氫二銨0.34％,pH4.9。與優(yōu)化前相比,全細(xì)胞脫氫酶活力提高了133.4％;菌體細(xì)胞量提高了12.8％。
　　 (2)通過(guò)搖瓶靜置發(fā)酵對(duì)O.oeni CECT4730發(fā)酵產(chǎn)酶的非營(yíng)養(yǎng)條件進(jìn)行了優(yōu)化,確定的最適條件為:種齡36 h,接種量10％,溫度30℃

5、,起始pH4.9,裝液量為200 ml/250ml。以7 L發(fā)酵罐進(jìn)行發(fā)酵放大試驗(yàn),發(fā)現(xiàn)接種前充入CO2形成厭氧環(huán)境更有利于該菌的生長(zhǎng)和產(chǎn)酶,該菌對(duì)剪切力敏感,最適攪拌轉(zhuǎn)速為50 r/min,與搖瓶靜置發(fā)酵相比,發(fā)酵周期縮短了約4 h,全細(xì)胞脫氫酶活力(12.91 U vs12.84 U)和菌體細(xì)胞量(OD600)(1.597 vs1.574)均有一定程度的提高。
　　 (3)運(yùn)用原位分離技術(shù)構(gòu)建了適合O.oeni CECT47

6、30全細(xì)胞催化反應(yīng)的新的TisHCl/正壬烷兩相反應(yīng)系統(tǒng)。通過(guò)對(duì)搖瓶反應(yīng)中的限制性因素的考察,發(fā)現(xiàn)VaVo(v/v)、pH、溫度、搖床轉(zhuǎn)速、輔助底物及底物濃度等均能對(duì)反應(yīng)產(chǎn)率和反應(yīng)初速度產(chǎn)生明顯影響,而只有pH和溫度能對(duì)產(chǎn)物ee值產(chǎn)生影響。在最適反應(yīng)條件下(VaVo1∶1、pH8.0、溫度30℃、搖床轉(zhuǎn)速150 r/min、輔助底物葡萄糖和細(xì)胞用量比5.4:1(m/m)、細(xì)胞和底物的用量比0.51∶1(g/mmol)),當(dāng)?shù)孜餄舛冗_(dá)到0

7、.94 mol/L時(shí),反應(yīng)24 h,時(shí)空產(chǎn)率的最大值比前期的研究提高了26.3％,達(dá)24 mmol/L·h,產(chǎn)物的ee(R)＞98％。
　　 (4)從2 L發(fā)酵液中約11 g濕菌體開(kāi)始目的酶的純化,經(jīng)超聲波破碎細(xì)胞、硫酸銨鹽析、Q-Sepharose-FF陰離子柱層析、Sephacryl S-200凝膠柱層析后,得到約0.36 mg電泳純的(R)-ADH,活力為254.5U/mg,酶活收率為2.4％,純化倍數(shù)約25.6倍。純酶的

8、催化反應(yīng)遵循反Prelog規(guī)則,還原2-辛酮得到的產(chǎn)物的ee(R)達(dá)到98.9％。
　　 (5)該酶的主要酶學(xué)性質(zhì)研究發(fā)現(xiàn):其分子量為100 kDa(±10 kDa),亞基分子量49 kDa(±2 kDa),為雙亞基結(jié)構(gòu)。最適pH為8.0,最適溫度為30℃,均與全細(xì)胞催化反應(yīng)的最適條件一致。Pb2+,Ag+,和Hg2+對(duì)其活力有較大的抑制作用;Fe3+,Cu2+和Zn2+次之。其底物選擇性按2-己酮＜2-庚酮＜苯乙酮＜2-辛酮的