鹽酸法降解殼聚糖制備特定聚合度殼寡糖(DP=5-7)的研究.pdf

1、本論文以殼聚糖為原料,用鹽酸在一系列條件下對其進行降解得到系列聚合度的殼寡糖混合物,采用葡聚糖凝膠柱分離,經(jīng)高效液相色譜法分析,13C和1H核磁共振表征,并結合專一性殼聚糖酶的酶解實驗,對其進行鑒定,從而確定了制備特定聚合度殼寡糖(DP=5-7)的方法。結果包括以下幾個方面:
　　(1)檢測聚合度5以上殼寡糖的薄層層析分離條件的確定。確立了以下薄層層析條件,能夠快速準確的檢測殼寡糖(DP=1-7)及其分布:HSGF254硅膠板,異

2、丙醇:水:氨水體積比為15:1:7.5展開劑系統(tǒng),香草醛溶液顯色劑,顯色條件為175℃烘10分鐘。
　　(2)獲得特定聚合度(DP=5-7)殼寡糖反應條件的篩選與確定。本實驗確立了鹽酸降解殼聚糖獲得殼寡糖反應的最佳條件為9M鹽酸體系,反應溫度為60℃。此條件下殼五糖與殼六糖含量最高,可達16.2％,高于以往報道。闡述了鹽酸法降解殼聚糖反應中各單因素與反應進程及產物的關系。在反應初始階段為一級反應,與其他研究者從糖類(如甲殼素、淀粉

3、和纖維素等)的酸水解過程得到的結果相一致。對比不同鹽酸濃度和不同溫度下實驗數(shù)據(jù)的極差發(fā)現(xiàn):溫度對于降解反應的影響稍顯著。不同反應時期的反應液中各聚合度殼寡糖組分的分布不盡相同,為保證實驗的穩(wěn)定性和可重復性,所取殼寡糖樣品來自于平衡反應液體系。
　　(3)特定聚合度殼寡糖(DP=5-7)的分離與鑒定。采用以葡聚糖凝膠Sephadex G-15(玻璃層析柱內直徑1.4cm,高108cm,裝填高度為100cm)為介質的層析法分離殼寡糖混

4、合物,獲得系列聚合度分布較窄的殼寡糖產物,實現(xiàn)了降解液中殼低聚糖混合物的初步分離。對上樣量進行優(yōu)化,選擇0.3g~0.4g上樣量得率可達55%以上。本實驗采用0.31g上樣量,去離子水以3.6ml/h的流速進行洗脫,每0.9ml組分進行收集,殼寡糖得率達到58%。為不同聚合度殼寡糖的研究做了有益的探索。
　　葡聚糖分離組分經(jīng)NH2P-504E柱(內直徑4.6 mm,長250 mm)高效液相色譜法鑒定,分析條件為:乙腈-水(70:3

5、0, v/v)以1ml/min的流速在30℃柱溫下進行洗脫,洗脫液由Waters2414折光示差檢測器在30℃下進行監(jiān)測。進樣體積為20?l。結果顯示:與標準品對照,反應液中檢測到了預期的主成分——殼寡糖五聚體(保留時間10.7min)和六聚體(保留時間13.3min)。同時HPLC圖譜中還出現(xiàn)了另一化合物X(保留時間16.6min)。
　　本研究提出了將殼聚糖酶應用于殼寡糖鑒定的新思路,通過聯(lián)合使用核磁共振圖譜、酶解產物分析的方

6、法,解析13C和1H核磁共振圖譜、結合專一性殼聚糖酶的酶解實驗,對化合物X進行表征和鑒定,核磁共振條件為:Bruker Avance400 MHz, D2O溶解;酶解條件為:殼聚糖酶粗酶粉(15U/mg,約1mg)與殼寡糖(約1mg)樣品在醋酸鈉緩沖溶液(50mM,pH6.0)中、37℃下保溫反應1h,結果表明:該化合物為殼低聚糖,且聚合度為7,即該化合物為殼七糖。本實驗首次成功地表征并鑒定了殼七糖,為更高聚合度殼寡糖的分離和鑒定提供了

7、有力的參考。
　　本實驗獲得了制備純度>90%的特定聚合度殼寡糖(DP=5-7)的方法,同時為高聚合度殼寡糖的研究及制備提供了有益的參考。本實驗制備的殼寡糖(DP=5-7)為高度脫乙?；瘹す烟?含量達到97%;若提高得率合并F-6與F-10其純度亦可達到90%以上;與殼寡糖標準品(DP=5-6)相比,有更好的外觀品質。殼聚糖經(jīng)過鹽酸反應其分解率達60%以上,其中殼寡糖(DP5-6)含量達16.2%;殼寡糖樣品經(jīng)過葡聚糖凝膠分離得率