腫瘤特異性MAGE-A3基因重組質粒的構建.pdf

1、腫瘤嚴重危害現代人類的健康及生命,特別是惡性腫瘤,具有很高的致死率.目前人們對腫瘤的治療主要依靠外科手術以及放療、化療等,近年來以腫瘤生物學特性為出發(fā)點研究新的腫瘤治療方法成為了一個重要的研究方向,基因免疫治療就是其中的熱點之一. 腫瘤基因免疫治療具有腫瘤高度特異性的特點,對正常細胞及組織幾乎不產生損傷.它依賴于細胞免疫和體液免疫兩大免疫系統(tǒng)的活化,而保證免疫治療成功的關鍵是發(fā)現并鑒定腫瘤特異性抗原. 黑色素瘤相關抗原3

2、 (Melanoma-associated antigens 3,MAGE-3、MAGE-A3)作為人類已經發(fā)現并鑒定的腫瘤特異性抗原,廣泛表達于人體的多種腫瘤組織及細胞,如黑色素瘤、頭頸部鱗癌、肝癌、肺癌、胃癌、乳腺癌等等.MAGE-A3基因在其他正常的組織中均不表達,除了睪丸生殖細胞.但是睪丸生殖細胞因為不表達MHC-Ⅰ/Ⅱ類分子因而不能遞呈MAGE抗原蛋白,所以MAGE-A3基因編碼抗原蛋白的表達不會引起免疫系統(tǒng)對睪丸組織的損害.

3、基于這些發(fā)現,人們對將MAGE-A3用于特異性的抗腫瘤免疫治療產生了濃厚的興趣. 經過多年的努力,人們發(fā)明的以MAGE基因為基礎的疫苗類型主要有:MAGE抗原肽/蛋白、表達MAGE蛋白的黑色素瘤細胞、附加了MAGE抗原肽或者基因的樹突狀細胞(Dendritic Cells,DCs)等等.蛋白疫苗的特點是含有己知和未知的CD8<'+>T細胞表位和CD4<'+>T細胞表位,不被特定的HLA表型所限制,既可通過MHC-Ⅰ類分子途徑,又

4、可通過MHC-Ⅱ類分子途徑激活抗腫瘤免疫應答,因此采用蛋白疫苗可能具有更大的臨床應用意義.本實驗通過RT-PCR方法從舌鱗癌細胞株Tca8113中擴增出MAGE-A3全長蛋白編碼序列,并將其克隆到原核表達載體pET-32a中構建出pET-32a/MAGE-A3重組載體,為進一步對重組載體的抗原蛋白的誘導表達及其表達產物在體內外特異性誘導細胞毒性T淋巴細胞(cytotoxicity Tlymphocyte,CTL)殺傷活性的研究提供實驗依

5、據. 方法:1、網上查詢獲得MAGE-A3基因序列,確定其編碼蛋白質的序列全長.2、設計引物擴增編碼蛋白質的目的片段,同時參照質粒載體pET-32a的圖譜在引物兩端分別增加酶切位點Sac Ⅰ和Xho Ⅰ.3、復蘇、培養(yǎng)舌鱗癌細胞株Tca8113,收集細胞,通過RT-PCR擴增出目的片段,目的片段切膠回收.4、回收目的片段通過TA克隆進行轉化、擴增,酶切鑒定,重組載體測序,并與網上序列比對同源性.5、用Sac Ⅰ和Xho Ⅰ核酸內

6、切酶雙酶切重組T載體和pET-32a質粒載體,進行連接,從而構建pET-32a/MAGE-A3原核表達重組質粒. 結果:1、通過RT-PCR可以從舌鱗癌細胞株Tca8113中擴增出目的片段.2、通過TA克隆可以獲得成功轉化的重組T載體,測序結果與網上序列有很高的同源性,并且未出現提前終止密碼子.3、通過雙酶切重組T載體和pET-32a質粒載體可以將目的片段與pET-32a質粒載體重組,構建出重組原核表達質粒pET-32a/MAG