Il-17-Th17及Th1-Th2在兒童哮喘中的作用研究.pdf

1、一.研究背景:
　　 支氣管哮喘是由嗜酸性粒細胞、肥大細胞、T細胞、氣道上皮細胞等多種炎性細胞共同參與，以氣流受限、氣道重塑為特征的氣道炎癥性疾病，在世界范圍內其發(fā)病率呈逐年增高的趨勢，每年因哮喘而死亡的病人數(shù)高達10萬人，造成巨大的社會負擔。支氣管哮喘哮喘的防治已成為當今世界共同關注的公共健康問題。
　　 Th細胞在哮喘的發(fā)生和發(fā)展過程中起重要的調節(jié)作用。既往的研究發(fā)現(xiàn)，Th1/Th2失衡是哮喘的基本病理生理表現(xiàn)，Th

2、2細胞釋放炎癥因子產生IL-4，IL-5，IL-9和IL-13等細胞因子，引發(fā)過敏性炎癥及Th2-相關組織損傷，最終導致哮喘的發(fā)病。IL-4，具有代表性的Th2類細胞因子，能促進B細胞的增殖、分化，抑制其凋亡，誘導IgG或IgM向IgE的轉化及多種炎性趨化因子的生成，加強局部嗜酸性粒細胞、Th2淋巴細胞、單核細胞及嗜堿粒細胞的募集，啟動并維持氣道炎癥反應，引起哮喘的發(fā)作。同時，也可以通過刺激杯狀細胞及纖維母細胞參與哮喘氣道的粘液高分泌與

3、氣道重塑。Th1細胞分泌IFN-γ、IL-2、LT-α、TNF-β等細胞因子，促進吞噬細胞的活化及調理素、補體的產生，對細胞內病原體的清除發(fā)揮防御作用。IFN-γ作為Th1細胞代表性細胞因子，能促進天然T細胞向Th1的分化，抑制Th2細胞分化，調節(jié)嗜酸粒細胞的募集和活化，減少局部炎癥細胞的浸潤，從而維持Th1/Th2細胞的平衡，對哮喘的發(fā)病起保護作用。隨著對哮喘研究的不斷深入，這一理論并不能完全解釋哮喘的發(fā)病機制。
　　 近年來

4、，區(qū)別于Th1、Th2的新型T淋巴細胞亞群Th17的發(fā)現(xiàn)，補充了這一理論。Th17特異產生的IL-17，可激活支氣管上皮細胞、成纖維細胞和血管內皮細胞，分泌IL-6、IL-8、粒細胞集落刺激因子(granulocyte colonystimulating factor，G-CSF)、前列腺素E2(prostaglandin E2，PGE2)、粘附分子（intercellular adhesion molecule-1，ICAM-1）等炎

5、癥因子;誘導中性粒細胞在局部的募集和活化，上調Th2細胞調控的嗜酸粒細胞炎癥，與氣道炎癥和氣道高反應(airway hyperresponsiveness，AHR)密切相關。尤其，在非特異性、非IgE依賴、非嗜酸粒細胞炎癥的哮喘中發(fā)揮重要作用。研究表明，IL-17促進氣道上皮細胞粘蛋白5B(mucin5B，MUC5B)和粘蛋白5A(MUC5A)的表達，引起哮喘氣道粘液的過度分泌。IL-17還可通過啟動一系列炎性反應，造成肺組織破壞、氣道

6、平滑肌痙攣、氣道上皮細胞損傷、上皮下纖維化等不良后果。因此，Th1/Th2細胞、IL-17/Th17可能共同參與了哮喘的發(fā)病機制，各T細胞亞群之間的平衡及其相互作用可能在哮喘的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮了一定作用。
　　 IL-17家族包括六個成員，分別為IL-17A，IL-17B，IL-17C，IL-17D，IL-17E，以及IL-17F.IL-17A有著極其廣泛的生物學作用，可能通過誘導炎癥調節(jié)因子產生參與包括支氣管哮喘在內的多種免疫

7、及炎癥反應。IL-17F與IL-17A有很大程度的同源性，其生物學功能也很相似。IL-17F可誘導IL-6、IL-8、TGF-β及ICAM-1等細胞因子，間接促進中性粒細胞在氣道的募集，影響氣道炎癥。既往研究發(fā)現(xiàn)哮喘病人經過敏原刺激后IL-17F基因表達上調，IL-17F能增強抗原誘導的過敏性炎癥反應，可能與哮喘的易感性存在相關性。
　　 遺傳及環(huán)境因素在哮喘中發(fā)揮著重要作用，隨著遺傳學的不斷發(fā)展，有關哮喘遺傳易感性的研究引起了

8、人們廣泛的興趣。目前據(jù)報道有超過100個哮喘相關基因被發(fā)現(xiàn)，如Toll樣受體2(TLR2)、IL-4RA、STAT6、絲聚蛋白(FLG)、TNF、白三烯C4合酶(LTC4S)、PTEN基因等。
　　 IL-17F基因長度為7742bp，包含3個外顯子，位于6號染色體長臂。研究發(fā)現(xiàn)此區(qū)域與哮喘及其表型相關。IL-17F SNP rs763780位于3號外顯子，該位點7488T/C堿基突變，使I7F第161位氨基酸由組氨酸(His)

9、變?yōu)榫彼?Arg)，蛋白質的改變導致IL-17F促進靶細胞分泌促炎因子的能力低下。作為一個功能位點，IL-17F His161Arg基因多態(tài)性已應用于多種疾病發(fā)生發(fā)展的關聯(lián)研究。IL-17F His161Arg被認為與炎性腸道疾病(inflammatory bowel disease，IBD)、潰瘍性結腸炎(ulcerative colitis，UC)、白塞氏病、胃癌、慢性疲勞綜合征(chronicfatigue syndrome，C

10、FS)等疾病有關。
　　 近年來，IL-17F基因多態(tài)性rs763780與哮喘的關聯(lián)性也引起了一些學者的關注。最新研究顯示在日本人群中rs763780(H161R)基因多態(tài)性(TC/CC)與哮喘的發(fā)病相關，且體外功能實驗揭示了IL-17F第3外顯子上組氨酸突變?yōu)榫彼?，突變的IL-17F純合子(CC)影響IL-17F與受體的結合力，還通過以下途徑造成其功能的缺失:不能磷酸化ERK1/2，阻斷了Raf-1—MAPK1/2—ERK1

11、/2信號傳導通路;不能誘導支氣管上皮產生細胞因子及趨化因子，包括IL-8、IL-6及GM-CSF等的表達;不能像野生型有效地增強嗜酸粒細胞性過敏反應及氣道重塑進程，因此降低了哮喘發(fā)生的風險。Ramsey CD等研究非裔和歐裔美國女性IL-17F基因分型，分析包括rs763780在內的50個SNPs未發(fā)現(xiàn)與哮喘相關。韓國學者Eun-Heui Jin等人分析了IL-17F基因多態(tài)性，結果顯示啟動序列rs1889570基因多態(tài)性與哮喘易感性有

12、關，rs763780基因分型及等位基因在哮喘與健康人群中無差異。哮喘是一種復雜的多因素參與的疾病，上述結果存在一定的差異，原因可能為基因的異質性及環(huán)境等因素的不同。不同人群中SNP的分布頻率不同，在Ramsey CD的研究中H161R在歐裔美國人的突變率為4.5％，遠低于日本人(11.4％)。同時哮喘是一種復雜的，多基因遺傳傾向的疾病，基因與基因之間有著相互作用及累積效應，從而使得遺傳因素存在差異。哮喘的易感性還與環(huán)境因素有關，如吸煙（

13、被動或主動）、空氣中粉塵、寵物、職業(yè)暴露等等。這些均可造成實驗結果的差異。目前國內外對于rs763780(H161R)基因突變與支氣管哮喘的相關性研究報道較少。
　　 二.研究目的:
　　 本實驗通過對哮喘患者血清中各T細胞亞群代表性細胞因子的檢測，擬探討IL-17/Th17、Th1/Th2在哮喘發(fā)病中的作用，分析哮喘的免疫學發(fā)病機制，同時初步研究IL-17F基因多態(tài)性與兒童支氣管哮喘的關聯(lián)性，為哮喘的免疫學治療方法及其

14、遺傳易感性的篩選提供一定的理論和實驗依據(jù)。
　　 三.材料與方法:
　　 1、研究對象及分組
　　 (1)2011年3月-2012年10月于本院門診隨診的60例哮喘患兒（臨床緩解期），男38例，女22例，年齡2-15歲，平均5.3歲。均符合2008年中華醫(yī)學會兒科學會呼吸學組制定的兒童支氣管哮喘診斷標準，入組前一周均無使用激素及急性感染病史。
　　 (2)對照組:2012年3月到2012年10月于本院健康

15、體檢兒童60例，男36例，女24例;年齡2-14歲，平均5.2歲。均無過敏性疾病病史，入組前一周均無使用激素及急性感染病史。
　　 (3)兩組兒童組間性別、年齡差異均無統(tǒng)計學意義，家長均知情同意參加該項研究。
　　 2、標本采集
　　 兩組兒童均于清晨空腹留取外周靜脈血3ml，其中1ml，于室溫(20～25℃)放置60min，2000r/min離心10min，制備血清，-70℃冰箱凍存?zhèn)錂z。另外2ml，提取全基因

16、組DNA，-20℃冰箱凍存?zhèn)錂z。
　　 1.3采用ELISA方法測定血清IL-4、IL-17、IFN-γ細胞因子水平。
　　 3、細胞因子IL-4、IL-17、IFN-γ的測定
　　 3.1采用ELISA方法測定血清IL-4、IL-17、IFN-γ細胞因子水平。所有的檢測步驟均嚴格按說明書進行，包括加樣、封板、水浴、洗板、加酶、顯色、讀取OD值等操作。
　　 4、IL-17F基因序列rs763780(H1

17、61R)基因多態(tài)性檢測
　　 4.1應用DNA測序法檢測rs763780(H161R)基因多態(tài)性
　　 (1)采用苯酚/氯仿提取法提取全基因組DNA。
　　 (2)設計引物。
　　 (3)PCR擴增目的基因。
　　 (4)基因測序及分析
　　 3、數(shù)據(jù)分析
　　 計量資料采用x2檢驗，計數(shù)資料采用t檢驗。用SPSS13.0進行統(tǒng)計分析， P＜0.05作為差異有顯著意義的檢驗標準。<

18、br>　　 四.結果:
　　 1、血清細胞因子IL-4、IL-17和IFN-γ水平檢測結果
　　 哮喘兒童與正常對照組比較，IL-4水平高于正常對照組，差異有統(tǒng)計學意義(t=45.97 P＜0.05)。
　　 哮喘兒童與正常對照組比較，IL-17水平高于正常對照組，差異有統(tǒng)計學意義(t=8.08 P＜0.01)。
　　 哮喘兒童與正常對照組比較，IFN-γ水平低于正常對照組，差異有統(tǒng)計學意義(t=19.

19、06 P＜0.001)。
　　 2.IL-17F基因序列rs763780(H161R)基因型在兩組內均未檢測到突變型CC。rs763780(H161R)基因型(TC/TT)在兩組間內的分布有明顯的差異(x2=5.71, P=0.017＜0.05)。
　　 3.TC基因型哮喘患兒與正常對照組比較，IL-4水平無統(tǒng)計學差異(t=22.69P＞0.05); IL-17水平無明顯差異(t=3.79 P＞0.05);干擾素水平低于

20、正常對照組，差異有統(tǒng)計學意義(t=12.92 P＜0.01)。
　　 TT基因型的哮喘組與正常對照組比較，血清IL-4水平在兩組間無統(tǒng)計學差異(t=38.43 P＞0.05); IFN-γ水平無統(tǒng)計學差異(t=14.26 P＞0.05); IL-17水平無統(tǒng)計學差異(t=3.77 P＞0.05)。
　　 不同基因型(TT/TC)哮喘患兒組血清中IL-4水平無明顯差異(t=0.38P＞0.05)。
　　 不同基因型

21、(TT/TC)哮喘患兒血清中IL-17水平無明顯差異(t=1.58P＞0.05)。
　　 不同基因型(TT/TC)哮喘患兒血清中IFN-γ水平有統(tǒng)計學明顯差異(t=0.93P＜0.05)。
　　 4.TC基因型OR和95％可信區(qū)間(CI)為2.09(1.12-3.90)，TT基因型OR和95％CI為0.76(0.60-0.95)。
　　 五.結論:
　　 本課題采用酶聯(lián)免疫吸附實驗、基因測序等方法，研究了

22、IL-4、IL-17、IFN-γ在哮喘發(fā)病中的作用以及IL-17F基因多態(tài)性與哮喘的相關性研究。通過研究我們得到以下結論:
　　 1、T細胞亞群的平衡與哮喘相關。哮喘患兒血清中IL-4、IL-17表達升高，IFN-γ分泌下降，提示我們哮喘患兒存在Th1細胞功能不足及Th2細胞功能亢進，IL-17/Th17可能在哮喘發(fā)病中發(fā)揮作用。
　　 2、IL-17F基因多態(tài)性rs763780(H161R)基因型分布(TC/TT)在兩