MLCK在失血性休克大鼠淋巴管收縮性與血管反應(yīng)性變化中的作用及其機(jī)制.pdf

1、背景：肌球蛋白輕鏈激酶(myosin light-chain kinase， MLCK)是決定淋巴管與血管收縮和舒張的關(guān)鍵酶。研究表明，失血性休克(hemorrhagic shock， HS)發(fā)展進(jìn)程中存在淋巴微循環(huán)障礙，淋巴管收縮功能與休克的發(fā)展密切相關(guān)，休克不同時(shí)相的淋巴管收縮性表現(xiàn)為雙相變化，即休克早期淋巴管收縮性增強(qiáng)、重癥休克期淋巴管收縮性降低，MLCK是否參與休克淋巴管收縮性的雙相調(diào)節(jié)，未見(jiàn)報(bào)道。同時(shí)發(fā)現(xiàn)，休克腸淋巴液回流是導(dǎo)

2、致血管低反應(yīng)性的重要因素，結(jié)扎腸系膜淋巴管或腸淋巴液引流均可提高休克大鼠的血管反應(yīng)性與鈣敏感性，MLCK是否參與休克腸淋巴液介導(dǎo)血管低反應(yīng)性的分子機(jī)制，值得研究。
　　 目的：本研究復(fù)制HS模型，針對(duì)休克淋巴管收縮性的雙相變化，采用離體淋巴管灌流技術(shù)，應(yīng)用MLCK工具藥，觀察MLCK對(duì)離體淋巴管泵活性的影響，探討MLCK在休克離體淋巴管收縮性雙相變化中的作用機(jī)制，為休克淋巴管收縮性的調(diào)控提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)；針對(duì)休克腸淋巴液對(duì)降低血管反

3、應(yīng)性的作用，采用離體血管張力測(cè)定技術(shù)，應(yīng)用MLCK工具藥，觀察MLCK對(duì)休克大鼠血管反應(yīng)性與鈣敏感性的影響，探討MLCK在休克腸淋巴液介導(dǎo)血管低反應(yīng)性與鈣失敏的作用機(jī)制，以腸淋巴途徑為切入點(diǎn)，為休克血管低反應(yīng)性的臨床干預(yù)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)與理論參考。
　　 方法與結(jié)果：
　　 第一部分、 MLCK在失血性休克大鼠離體淋巴管收縮性雙相變化中的作用及其機(jī)制
　　 方法：Wistar雄性大鼠隨機(jī)均分為對(duì)照組、Shock組（復(fù)

4、制HS模型，分為休克0h、0.5h、1h、2h、3h亞組），所有大鼠經(jīng)戊巴比妥鈉肌肉注射麻醉后，行股部手術(shù)，右股靜脈注射肝素鈉全身抗凝，右股動(dòng)脈插管連接生物信號(hào)采集系統(tǒng)，連續(xù)監(jiān)測(cè)平均動(dòng)脈血壓(mean artery pressure，MAP);左側(cè)股動(dòng)脈插管后連接注射器固定于抽注機(jī)上備放血用。待所有手術(shù)完成、穩(wěn)定30min后，休克組大鼠經(jīng)左股動(dòng)脈勻速放血，10min內(nèi)將MAP降至40mmHg，復(fù)制失血性休克模型。對(duì)照組大鼠進(jìn)行相同的手術(shù)

5、操作，但不放血。在對(duì)照組完成手術(shù)后30min、休克各組在相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)，留取胸導(dǎo)管組織，用于Western blot法檢測(cè)MLCK蛋白表達(dá)；利用離體淋巴管分離技術(shù)，在對(duì)照組完成手術(shù)穩(wěn)定30min后、休克大鼠各時(shí)間點(diǎn)，分離胸導(dǎo)管，手術(shù)顯微鏡下分離干凈胸導(dǎo)管周圍組織，制備離體淋巴管，移入微血管壓力-直徑測(cè)定儀的浴槽內(nèi)、固定、孵育，待淋巴管出現(xiàn)穩(wěn)定的自發(fā)性收縮后，觀察淋巴管在不同跨壁壓(1cmH2O、3cmH2O、5cmH2O)下的收縮頻率（co

6、ntraction frequency， CF）、收縮末期口徑(end systolic diameters， ESD)、舒張末期口徑(end diastolic diameters， EDD)、被動(dòng)管徑(passive(relaxed) diameters， PD)的變化，根據(jù)檢測(cè)的淋巴管各口徑和頻率，以緊張指數(shù)(tonic index， TI)、收縮幅度(contraction amplitude， CA)、泵流分?jǐn)?shù)（fractio

7、nal pump flow， FPF）等指標(biāo)，結(jié)合CF作為評(píng)價(jià)淋巴管活性的指標(biāo)。其中：TI=(PD-EDD)/PD×100％;CA=(EDD-ESD)/PD×100％;FPF=(EDD2-ESD2)/EDD2×CF。同時(shí)另取shock0.5h與2h組大鼠的淋巴管條，分別與MLCK抑制劑ML-7、激動(dòng)劑P物質(zhì)( SP)單獨(dú)或共同孵育(具體分組為：shock0.5h+ML-7、shock0.5h+ML-7+SP、shock2h+SP、sho

8、ck2h+SP+ML-7)，觀察MLCK在休克淋巴管收縮性雙相變化中的作用。
　　 結(jié)果：Shock0h和0.5h淋巴管組織MLCK蛋白顯著高于對(duì)照組；隨著休克發(fā)展，MLCK蛋白表達(dá)逐漸降低。在1、3、5cmH2O等多個(gè)跨壁壓下，shock0.5h組淋巴管的CF、TI、FPF均顯著高于對(duì)照組，ML-7可顯著下調(diào)這些指標(biāo)，SP則可明顯降低ML-7的作用，使之恢復(fù)至shock0.5h水平；shock2h組淋巴管的CF、TI、FPF均

9、顯著低于對(duì)照組，SP可顯著上調(diào)這些指標(biāo)，ML-7則可顯著降低SP的作用。shock0.5h與2h離體淋巴管CA與對(duì)照組相比無(wú)顯著變化，SP可降低shock2h淋巴管的CA、ML-7可抑制該作用，但二者對(duì)shock0.5h無(wú)明顯作用。結(jié)果表明，MLCK作為影響淋巴管平滑肌細(xì)胞收縮的關(guān)鍵酶，參與了HS發(fā)展進(jìn)程中淋巴管收縮性的雙相調(diào)節(jié)。
　　 第二部分 MLCK在休克腸淋巴液介導(dǎo)大鼠血管低反應(yīng)性中的作用及其機(jī)制
　　 方法：2

10、4只Wistar雄性大鼠隨機(jī)均分為假手術(shù)組(Sham)、休克組(Shock)、休克腸淋巴液引流1組(shock mesenteric lymph drainage from shock0h， shock+drainage0-3h)、休克腸淋巴液引流2組(shock mesenteric lymph drainage from shock1h， shock+drainage1-3h)，所有動(dòng)物均行股部手術(shù)用于復(fù)制HS模型、腹部手術(shù)用于腸系

11、膜淋巴管剝離，其中shock+drainage0-3h與shock+drainage1-3h組大鼠行腸系膜淋巴管插管，分別于休克0h、1h引流休克腸淋巴液至休克3h。待所有手術(shù)完成、穩(wěn)定30min后，休克組與引流組大鼠按前述方法復(fù)制動(dòng)物模型；假手術(shù)組進(jìn)行相同的手術(shù)操作，但不放血。休克組、兩個(gè)引流組在維持低血壓3h后、假手術(shù)組在相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)，留取腸系膜上動(dòng)脈(superior mesenteric artery， SMA)，每根SMA制備2

12、條血管環(huán)，一條用于血管反應(yīng)性觀察，另一條用于鈣敏感性測(cè)定。另取12只大鼠，作為shock組與shock+drainage1-3h組(n=6)，每只動(dòng)物制備2根血管環(huán)，shock組血管環(huán)和休克組大鼠的血管環(huán)分別與MLCK激動(dòng)劑SP孵育、shock+drainage1-3h組大鼠的血管環(huán)與MLCK抑制劑ML-7孵育后，進(jìn)行血管反應(yīng)性與鈣敏感性測(cè)定，評(píng)價(jià)MLCK在休克腸淋巴液介導(dǎo)大鼠血管低反應(yīng)性中的作用。
　　 結(jié)果：Shock3h組

13、大鼠的血管環(huán)對(duì)各濃度NE、shock+drainage0-3h組大鼠的血管環(huán)對(duì)NE(自10-8mol/L起)的收縮反應(yīng)性均顯著低于sham組，shock+drainage1-3h組大鼠的血管環(huán)對(duì)各濃度NE的收縮反應(yīng)性與sham組均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；shock+drainage0-3h組自NE濃度10-6mol/L起、shock+drainage1-3h組自10-8mol/L起均顯著高于shock3h組；且shock+drainage1-3h

14、組自10-7mol/L起均顯著高于shock+drainage0-3h組。Shock3h組大鼠血管環(huán)對(duì)梯度鈣離子（自10-4mol/L起）、shock+drainage0-3h組在10-2mol/L、3×10-3mol/L時(shí)的收縮性均顯著低于sham組，shock+drainage1-3h組大鼠的血管環(huán)對(duì)各濃度鈣離子的收縮反應(yīng)性與sham組均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；shock+drainage0-3h、shock+drainage1-3h組自10

15、-4mol/L起均顯著高于shock3h組；且shock+drainage1-3h組自10-3mol/L起均顯著高于shock+drainage0-3h組。同時(shí)，shock3h對(duì)梯度NE與鈣離子Emax、pD2、shock+drainage0-3h組對(duì)梯度NE的Emax、pD2以及梯度鈣離子的Emax均分別顯著低于sham組，shock+drainage0-3h、shock+drainage1-3h組血管環(huán)對(duì)梯度NE與鈣離子Emax均顯

16、著高于shock3h組，且shock+drainage1-3h組對(duì)梯度NE與鈣離子Emax均顯著高于shock+drainage0-3h組。研究結(jié)果表明，自休克1h起引流腸淋巴流可顯著提升大鼠血管反應(yīng)性與鈣敏感性。進(jìn)一步應(yīng)用MLCK激動(dòng)劑SP與shock3h、抑制劑ML-7與shock+drainage1-3h血管環(huán)孵育后，在NE濃度為10-6mol/L、10-5mol/L、10-4mol/L時(shí)，SP顯著提高了shock3h、ML-7顯

17、著降低了shock+drainage1-3h組的血管反應(yīng)性；在鈣離子濃度為10-3 mol/L、3×10-3mol/L、10-2mol/L、3×10-2mol/L時(shí)，SP提高了shock3h、ML-7顯著降低了shock+drainage1-3h組血管環(huán)的鈣敏感性；兩組大鼠血管環(huán)與工具藥孵育后，NE為10-9mol/L、10-8mol/L、10-7mol/L時(shí)的血管反應(yīng)性、在鈣離子濃度為3×10-5mol/L、10-4mol/L、3×1

18、0-4mol/L時(shí)的鈣敏感性，兩組間均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)變化。同時(shí)，SP顯著提高了shock3h血管環(huán)對(duì)梯度NE的Emax、對(duì)梯度鈣離子的Emax、pD2、但仍低于sham組，ML-7抑制了shock+drainage1-3h組血管環(huán)對(duì)梯度NE與鈣離子的Emax、但仍高于shock3h組。研究結(jié)果提示，MLCK參與了休克腸淋巴液介導(dǎo)血管低反應(yīng)性、鈣失敏的作用機(jī)制。
　　 結(jié)論：MLCK在失血性休克后淋巴管收縮性的雙相變化中發(fā)揮重要作用，以