腸道蛋白酶在失血性休克大鼠炎癥反應中的作用.pdf

1、當各種外源性與內源性因子引起機體組織和細胞損傷性變化時,機體的局部和全身也發(fā)生著一系列復雜的反應,以局限和消滅損傷因子,消除和吸收壞死組織,并修復損傷,這種復雜的以防御為主的反應稱為炎癥反應。因此任何疾病的發(fā)生都伴隨著炎癥反應,包括感染、創(chuàng)傷、失血等各種急性和慢性疾病。然而,當炎癥反應在初期未能得到及時有效的治療時,隨后機體產(chǎn)生的多種炎性介質即可形成“瀑布效應”,使炎性反應擴大,甚至失去控制,導致全身炎癥反應綜合征(Systemic I

2、nflammatory Response Syndrome,SRJS)的形成,進而發(fā)展為多器官功能衰竭(Multiple Organ Dysfunction Syndrome,MODS),甚至死亡。因此,早期抑制炎癥反應,對于控制疾病的進展,防止其進一步惡化發(fā)揮著重要的作用。
　　 經(jīng)過幾十年的研究,當炎癥反應啟動時,機體發(fā)生的生理變化已經(jīng)明確,包括血管滲透性增高、血液流變學改變、白細胞與血小板黏附、紅細胞聚集、實質細胞死亡等。

3、80年代,白細胞黏附和氧自由基的形成被認為是炎癥反應中重要的一部分。但是,實施清除氧自由基、抑制白細胞黏附等干預手段,對于抑制炎癥反應的效果卻十分有限。于是科學家們不斷探索,究竟是什么機制觸發(fā)了炎癥反應,導致炎癥反應在短時間內迅速發(fā)展為SRIS和MODS呢?
　　 腸道的作用在多器官功能衰竭的發(fā)病機制中一直占有重要位置。1986年Meckins和Marshall首先提出腸道是發(fā)生MODS的原動力。90年代,Chang TW研究也

4、證明腸道組織在失血性休克中的重要作用。在實驗前切除大鼠全部小腸和部分大腸組織,可明顯提高休克復蘇后大鼠的存活率。但是,Chang TW并沒有闡述在休克發(fā)生時,切除腸道組織在減輕機體損害方面的作用機制。近年來的研究進一步表明,腸道作為體內最大的“儲菌庫”和“內毒素庫”,憑借其在體內獨特的生理環(huán)境,參與了SIRS和MODS的病理生理過程。很多學者提出了腸道細菌/內毒素易位學說,認為在創(chuàng)傷、休克、應激等情況下,由于腸道缺血、腸上皮細胞損害,導

5、致腸黏膜屏障功能受損,腸道內細菌和內毒素易位,為炎性反應提供了豐富的刺激物質,導致炎性反應的持續(xù)發(fā)展進而引起SIRS及MODS。但是,隨著研究的深入,越來越多的研究結果與腸道細菌/內毒素易位學說相矛盾。Koh研究顯示,僅在動物淋巴結及輸入淋巴管中培養(yǎng)出細菌,而在輸出淋巴管中未能培養(yǎng)出細菌。臨床試驗也證明,選擇性腸道去污或抗內毒素治療法不能有效提高生存率。那么是否還存在其他機制,引發(fā)了休克發(fā)生時所伴隨的高水平的炎癥反應呢?
　　

6、近些年,美國Geert W.Schmid—Sch6nbein的研究認為,腸道內的蛋白酶引起腸壁組織的分解,產(chǎn)生活性因子,是創(chuàng)傷、休克等重癥時引發(fā)全身炎癥反應綜合癥,進而發(fā)展為多器官功能衰竭,甚至死亡的關鍵因素,即“自身消化”理論。當機體受到各種損害因子侵犯時,腸道黏膜受損,屏障作用減弱,胰腺消化酶進入黏膜下層,甚至肌層,引起腸壁組織的自身消化。由此產(chǎn)生各種活性因子,激活炎癥細胞,釋放炎癥介質,引起機體一系列炎性反應。這些活性因子和炎癥介

7、質可通過腸壁淋巴循環(huán)和門靜脈循環(huán)進入全身循環(huán)系統(tǒng),也可直接滲透進入腹腔,引起遠隔組織和器官的損害。
　　 研究顯示,在腸道缺血再灌注大鼠模型中,提前通過腸道內灌注絲氨酸蛋白酶抑制劑加貝酯或耐莫司他的實驗組大鼠,再灌注后大鼠的存活率明顯提高；檢測血漿活性水平,與對照組相比,實驗組大鼠血漿活性水平也明顯減低,炎癥反應減弱。
　　 失血性休克發(fā)生時,也伴隨著高水平的炎癥反應,若不能及時抑制,可最終引起多器官功能衰竭,導致死亡。

8、烏司他丁是臨床上常用的蛋白酶抑制劑,通過靜脈使用,其在治療急性胰腺炎、抗休克治療、體外循環(huán)心臟手術等方面的治療效果已經(jīng)得到肯定。但是,尚沒有關于腸道內使用烏司他丁的相關研究報道。因此,本實驗在建立失血性休克大鼠模型的基礎上,通過腸道內給予蛋白酶抑制劑烏司他丁,探討是否能夠抑制腸道內蛋白酶的自身消化作用,抑制炎癥反應,對失血性休克起到一定治療作用。為失血性休克的治療提供新的思路與方法。
　　 材料與方法
　　 1、動物及分

9、組
　　 28只健康清潔級wistar大鼠,雌雄不限,體重220-270g。隨機分成四組:未灌注腸道組、鹽水灌注腸道組、烏司他丁灌注腸道組和烏司他丁靜脈組(見表1),每組7只。術前二十四小時正常飲食、飲水。
　　 2、失血性休克模型的制備
　　 健康wistar大鼠,以3％戊巴比妥鈉50 mg/kg腹腔注射麻醉。麻醉成功后,稱取大鼠體重。將大鼠仰臥位固定于實驗手術板上,各皮、消毒,進行右側股動脈、股靜脈游離術。游

10、離好動、靜脈后,以24號套管針分別行股動脈、股靜脈置管,以絲線結扎固定。插管后,立即注入0.3ml肝素生理鹽水(含肝素300U)。股動脈套管經(jīng)三通閥與動脈套裝相連,然后連接于血壓監(jiān)護儀,監(jiān)測平均動脈壓變化。股靜脈套管與三通閥和2ml注射器相連,用于靜脈給藥。置管術完成后,于上腹部正中備皮、消毒,打開腹腔。分別于十二指腸上端、回腸末端插入軟管,以絲線結扎固定,用于腸道灌洗。
　　 以上操作完成后,除未灌注腸道組,其余三組分別將50

11、ml37℃生理鹽水通過輸液泵經(jīng)十二指腸上端管道恒壓恒速灌入腸道,最后經(jīng)回腸末端將腸內容物沖出。灌洗結束后,各組大鼠均經(jīng)股動脈放血(30min內完成)至平均動脈壓40±5 mm Hg,并間斷回輸或放血維持此血壓。休克模型制作成功后,烏司他丁灌注腸道組腸道內給予烏司他丁(50000U/Kg)鹽溶液10ml,靜脈給予生理鹽水0.5ml；烏司他丁靜脈組靜脈給予烏司他丁(50000U/Kg)鹽溶液0.5ml,腸道給予生理鹽水10ml；鹽水灌注腸道

12、組分別通過腸道和靜脈給予生理鹽水10ml、0.5ml；未灌注腸道組僅靜脈給予生理鹽水0.5ml。
　　 3、檢測指標
　　 3.1休克前后平均動脈壓變化
　　 通過心電監(jiān)護儀觀察并記錄大鼠休克前后平均動脈壓的變化。記錄時間點分別為:插管后、灌注開始、灌注10min、灌注結束、休克、休克30min、60min、90min、120min和180min,共10個時間點。
　　 3.2生存時間
　　 通過

13、觀察平均動脈壓的變化,記錄從休克模型制作成功后到大鼠死亡的時間。當大鼠心臟停止跳動,未經(jīng)處理5min沒有變化,確定為死亡。
　　 3.3血漿活性因子誘導人中性粒細胞黏附分子CD11b的表達
　　 將休克后大鼠血漿與健康人全血混合培養(yǎng),血漿中的活性因子可激活人中性粒細胞,促使細胞表面CD11b的表達增加。通過流式細胞術檢測中性粒細胞表面CD11b的表達變化。
　　 在休克前、休克120min和180min分別取動脈

14、血0.5ml,含肝素10u/ml。其中20μ1用于白細胞計數(shù),剩余全血離心500g,5min,取上層血漿-80℃保存?zhèn)錂z。
　　 取健康志愿者全血25ml,將50μl老鼠血漿與200μl健康志愿者全血混合,再加入DMEM培養(yǎng)基200μl,混勻后放入37℃培養(yǎng)箱孵育4小時。孵育結束后,取出加入FITC標記的抗人中性粒細胞CD11b單克隆抗體,輕輕震蕩混勻后于黑暗處置于冰上45min。用紅細胞裂解機裂解紅細胞,PBS緩沖液洗滌白細胞

15、三次,最后將標本放入流式細胞儀中,檢測CD11b的表達。FITC結合的同種人的IgGl抗體作為非特異性抗體結合的同種對照,數(shù)據(jù)用百分數(shù)表示。
　　 3.4白細胞計數(shù)
　　 采用手工計數(shù)法計量休克前、休克120min和180min時外周血白細胞數(shù)目。將冰醋酸2ml加入到98ml蒸餾水中,再加入10g/L亞甲藍溶液3滴,混勻過濾后制成白細胞稀釋液。取稀釋液0.38ml于試管中,加入大鼠全血標本20μl混勻。滴少量于血球計數(shù)板

16、上,充池、靜置2-3min后在光學顯微鏡下計數(shù)。
　　 3.5腸道黏膜病理變化
　　 老鼠死亡后,在距屈氏韌帶5cm處取空腸組織約4cm,用0.9％生理鹽水反復沖洗4次,取中間2cm組織4％甲醛固定。經(jīng)脫水、浸蠟、包埋、切片、染色后制成病理切片,在光學顯微鏡下觀察比較不同處理組大鼠腸道黏膜的病理變化。
　　 4、統(tǒng)計學處理
　　 采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件進行處理,計量資料以(x)±s表示。采用重復測量

17、數(shù)據(jù)的方差分析和完全隨機設計多樣本比較的方差分析,P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。
　　 結果
　　 1、休克前后平均動脈壓變化
　　 采用重復測量數(shù)據(jù)的方差分析,比較休克前四個菌點組問、組內差異。結果顯示:不同處理組的組間效應,F=0.904(P=0.454,>0.05),說明不同處理組休克前血壓變化無統(tǒng)計學差異；組內不同時間點比較,F=1.174(P=0.322,>0.05),說明休克前不同時間點血壓變化無統(tǒng)

18、計學差異。
　　 比較休克后各組大鼠組間差異,F=5.814(.P=0.006,<0.05),說明經(jīng)不同處理后,休克后大鼠血壓變化有統(tǒng)計學差異。烏司他丁灌注腸道組與鹽水灌注腸道組比較,血壓明顯升高,有統(tǒng)計學差異(P=0.004,<0.05):烏司他丁靜脈組與鹽水組比較,血壓也升高,具有統(tǒng)計學差異(P=0.049,<0.05)。但烏司他丁腸道組和靜脈組比較(P=0.224,>0.05),鹽水灌注腸道組和未灌注腸道組比較(P=0.5

19、44,>0.05),差異均無統(tǒng)計學意義。
　　 2、生存時間比較
　　 采用完全隨機設計多樣本比較的方差分析,比較不同處理組大鼠生存時間。結果顯示:烏司他丁灌注腸道組與未灌注腸道組比較,生存時間延長,有統(tǒng)計學差異(P=0.008,<0.05):與鹽水灌注組比較,生存時間延長,有統(tǒng)計學差異(P=0.013,<0.05)；與烏司他丁靜脈組比較,生存時間也延長,具有統(tǒng)計學差異(P=0.039,<0.05)。但是,烏司他丁靜脈組

20、與鹽水灌注組、未灌注組比較,無統(tǒng)計學差異(P>0.05)。
　　 3、血漿活性因子誘導人中性粒細胞黏附分子CD11b的表達
　　 (1)比較休克前各組大鼠血漿激活人中性粒細胞CD11b的表達,F=0.147(P=0.930,>0.05),說明休克前各組大鼠血漿活性無統(tǒng)計學差異。
　　 (2)比較休克120min時各組大鼠血漿激活人中性粒細胞CD11b的表達:烏司他丁灌注腸道組與未灌注腸道組比較,CD11b的表達降

21、低,具有統(tǒng)計學差異(P=0.001,<0.05)；與鹽水灌注組比較,CD11b的表達降低,具有統(tǒng)計學差異(P=0.004,<0.05)；與烏司他丁靜脈組比較,表達也降低,具有統(tǒng)計學差異(P=0.004,<0.05)。烏司他丁靜脈組與鹽水組比較,差異無統(tǒng)計學意義(P=1.000,>0.05)。
　　 (3)比較休克180min時各組大鼠血漿激活人中性粒細胞CD11b的表達:烏司他丁灌注腸道組與未灌注腸道組比較,CD11b的表達降低

22、,具有統(tǒng)計學差異(P=0.040,<0.05)；與鹽水灌注組比較,CD11b的表達降低,具有統(tǒng)計學差異(P=0.048,<0.05)；與烏司他丁靜脈組比較,表達也降低,具有統(tǒng)計學差異(P=0.033,<0.05)。烏司他丁靜脈組與鹽水組比較,差異無統(tǒng)計學意義(P=0.962,>0.05)。
　　 4、外周血白細胞數(shù)目
　　 (1)比較休克前各處理組大鼠外周血白細胞數(shù)目:F=0.508(P=0.681,>0.05),說明休

23、克前各組大鼠外周血白細胞數(shù)目無統(tǒng)計學差異。
　　 (2)比較休克120min時各處理組大鼠外周血白細胞數(shù)目:烏司他丁灌注腸道組與未灌注腸道組比較,白細胞數(shù)目升高,具有統(tǒng)計學差異(P<0.001)；與鹽水灌注腸道組比較,白細胞數(shù)目升高,具有統(tǒng)計學差異(P<0.001)；與烏司他丁靜脈組比較,白細胞數(shù)目也升高,具有統(tǒng)計學差異(P<0.001)。烏司他丁靜脈組與鹽水灌注組比較,無統(tǒng)計學差異(P=0.767,>0.05)。
　　

24、 (3)比較休克180min時各處理組大鼠外周血白細胞數(shù)目:烏司他丁灌注腸道組與未灌注腸道組比較,白細胞數(shù)日升高,具有統(tǒng)計學差異(P<0.001)；與鹽水灌注腸道組比較,白細胞數(shù)目升高,具有統(tǒng)計學差異(P=0.001,<0.05)；與烏司他丁靜脈組比較,白細胞數(shù)目也升高,具有統(tǒng)計學差異(P=0.001,<0.05)。烏司他丁靜脈組與鹽水組比較,差異無統(tǒng)計學意義(P=0.787,>0.05)。
　　 5、腸道黏膜病理變化
　

25、　 未灌注腸道組大鼠小腸黏膜固有層充血明顯,伴有大量炎性細胞浸潤。腸絨毛數(shù)量減少,部分變短變粗,形態(tài)不規(guī)則,甚至出現(xiàn)絨毛斷裂現(xiàn)象,腸腔內可見大小不等的絨毛碎片。上皮細胞排列紊亂,形態(tài)大小不一,可見細胞變性、壞死等。鹽水灌注腸道組和烏司他丁靜脈組腸道黏膜損害程度較未灌注腸道組略有減輕。烏司他丁灌注腸道組損害程度最輕。
　　 結論:
　　 1、腸道內灌注烏司他丁可以延緩失血性休克大鼠休克后血壓下降過程,最終延長存活時間。<