EHEC O157-H7 Stx2B-Tir-Stx1B-Zot重組菌的構(gòu)建及其免疫原性的研究.pdf

1、食源性病原微生物是當今世界上不斷增多的食品安全和突發(fā)性公共衛(wèi)生事件的主要誘因.其中,腸出血性大腸桿菌（enterohaemorrhagic Escherichia coli,EHEC）0157:H7可致人腹瀉、出血性結(jié)腸炎、還可在5％-10%的病例中引發(fā)溶血性尿毒綜合征(Hemolytic uremic syndrome,HUS)及血栓性血小板減少紫癜等嚴重并發(fā)癥,嚴重者可致死亡.近20余年來,EHEC0157:H7引發(fā)的食物中毒在世界

2、各地包括中國都有不同規(guī)模的暴發(fā)流行．
　　 在我們研究中選用EHEC0157:H7三個主要的毒力基因tir,stx2b和stxlb,運用原核表達系統(tǒng)在體外進行串聯(lián)表達,獲得重組蛋白．選擇能夠增強腸通透的霍亂弧菌封閉小帶毒素zot基因進行串聯(lián),希望能夠增強機體的粘膜免疫,尤其是腸道的粘膜免疫．選用鏈霉素處理的Balb/c小鼠作為評價動物,皮下和鼻腔兩個途徑免疫Stx2B-Tir-StxlB-Zot蛋白,通過測定血清中的IgG滴度和

3、IgA滴度、糞便中的lgA滴度以及糞便排菌來衡量Stx2B-Tir-StxlB-Zot蛋白的免疫原性,為EHEC0157:H7亞單位疫苗的研制篩選良好的免疫原.
　　 1．腸出血性大腸桿菌0157:H7tir基因重組蛋白的表達及鑒定
　　 克隆、表達腸出血性大腸桿菌（enterohaemorrhagic Escherichia coli,EHEC）0157:H7轉(zhuǎn)位緊密素受體（tir)基因,并研究其免疫原性.選用pET2

4、8原核表達載體,構(gòu)建pET28-tir重組質(zhì)粒,并在大腸桿菌BL21中進行高效表達.選用家兔制備高滴度多克隆抗體,Western blot分析其免疫原性.結(jié)果顯示成功獲得高效表達的重組Tir蛋白,并制備了兔源Tir多克隆抗體,Western blot分析此抗體能與EHEC0157:H7的天然Tir蛋白發(fā)生特異性抗原抗體反應(yīng).我們在大腸桿菌中成功克隆表達了tir基因,所獲重組Tir蛋白具有良好的反應(yīng)原性.
　　 2．大腸桿菌015

5、7:H7Tir重組蛋白的生物學特性
　　 以HEp-2細胞為模型,評價重組Tir蛋白制備的抗體是否能夠抑制EHEC0157:H7的粘附和A/E損傷的形成.應(yīng)用純化后的重組Tir蛋白,皮下免疫Balb/c小鼠進行免疫保護性實驗.兩免斷尾采血,間接ELISA測定血清特異性抗體效價.二免14d,1010 CFUEHEC0157:H7口服灌胃攻毒.每隔兩天采集糞便檢測排菌量.結(jié)果顯示：表達的Tir蛋白具有天然Tir蛋白的功能特性,其抗體

6、能夠較大程度地抑制EHEC0157:H7對HEp-2細胞的粘附和A/E損傷的形成.二免Balb/c小鼠存活率高達100%,排菌減少,8d后檢測不到排菌,而對照組在第16d仍然能檢測到排菌.因此,體外表達的重組Tir蛋白具有良好的抗原性,可作為EHEC0157:H7基因工程疫苗研制的首選抗原之一．
　　 3．腸出血性大腸桿茵0157:H7 Stx2B-Tir-StxlB-Zot多價融合蛋白表達及鑒定
　　 EHEC0157

7、:H7主要定植在腸道內(nèi),研制能夠增強粘膜免疫基因工程疫苗具有很大優(yōu)勢.構(gòu)建表達tir和stxb的融合基因,將tir基因中間295個氨基酸殘基（Tit295）與stxB亞基基因72個氨基酸串聯(lián)構(gòu)建pGEX-stx2b-tir-stxlb重組質(zhì)粒,并與霍亂弧茵封閉小帶毒素(Zot)靠近C端基因串聯(lián),構(gòu)建重組質(zhì)粒pGEX-stx2b-tir-stxlb-zot,轉(zhuǎn)化于BL21(DE3),用IPTG進行誘導表達,經(jīng)SDS-PAGE電泳檢測,該融

8、合蛋白獲得了高效表達,主要以可溶性形式存在于茵體胞漿中.Western blot鑒定顯示,Stx2B-Tir-StxlB-Zot具有良好的反應(yīng)原性.
　　 4．大腸桿茵0157:H7 Stx2B-Tir-StxlB-Zot重組蛋白的免疫原性
　　 Stx2B-Tir-StxlB-Zot重組蛋白,分別皮下和鼻腔免疫Balb/c小鼠,二次免疫后測定血清中IgG和IgA滴度,糞便中IgA滴度.定期采集糞便,測定糞便排菌情況.結(jié)

9、果顯示：鼻腔免疫后Balb/c小鼠存活率100%,攻毒7d后檢測不到排菌,并且最高排菌量只有3×103CFU/0.1g,血清中IgG滴度接近105,糞便中IgA接近102;皮下免疫后Balb/c小鼠存活率88%,攻毒9d后檢測不到排菌,并且最高排茵量只有1.1×105CFU/O.1g,血清中IgG滴度也接近105,糞便中檢測不到IgA.Stx2B-Tir-StxlB-Zot鼻腔免疫能夠發(fā)揮更好的免疫原性,可以作為EHEC0157:H7亞