組織工程化骨的構(gòu)建與玻璃化凍存的體外實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的: 組織工程化骨(TEB)是目前骨缺損修復(fù)理想的骨移植材料之一，但常規(guī)的體外構(gòu)建過(guò)程需要一段時(shí)間，無(wú)法滿足臨床上即刻骨缺損修復(fù)的要求。本研究針對(duì)這一問(wèn)題進(jìn)行了兩種解決方案的體外實(shí)驗(yàn)研究。 1. 有實(shí)驗(yàn)報(bào)道用骨髓單個(gè)核細(xì)胞(BMNCs)復(fù)合材料即刻構(gòu)建的組織工程化骨進(jìn)行體內(nèi)骨缺損的即刻修復(fù)有一定的效果。但無(wú)體外實(shí)驗(yàn)對(duì)此方案的成骨效果進(jìn)行論證，為此本實(shí)驗(yàn)通過(guò)在成骨誘導(dǎo)環(huán)境的體外檢測(cè)來(lái)對(duì)此方案進(jìn)一步加以驗(yàn)證。 2.

2、 常規(guī)構(gòu)建的組織工程化骨若能獲得理想的深低溫保存效果則可作為實(shí)現(xiàn)即刻骨缺損修復(fù)的另一方案。玻璃化凍存是目前最有發(fā)展前景的凍存方法，因此本實(shí)驗(yàn)進(jìn)行體外檢測(cè)來(lái)驗(yàn)證玻璃化凍存TEB的可行性。 方法: 1. 用1.063g/mLPercoll液分離Beagle犬骨髓單個(gè)核細(xì)胞(cBMNCS)。將豬股骨頭制備成直徑5毫米(mm)、厚度1mm的部分脫鈣骨(pDBM)支架材料。通過(guò)cBMNCs在pDBM上粘附率的檢測(cè)，獲得理想的細(xì)胞接

3、種密度。用此密度的cBMNCs分別經(jīng)過(guò)誘導(dǎo)培養(yǎng)或常規(guī)培養(yǎng)的第二(P2)代成骨誘導(dǎo)或未誘導(dǎo)犬骨髓基質(zhì)干細(xì)胞(cBMSCs)復(fù)合pDBM常規(guī)構(gòu)建的TEB與該密度cBMNCs復(fù)合pDBM即刻構(gòu)建的TEB共同進(jìn)行成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)，體外分析比較各自的細(xì)胞活性和成骨能力。 2. 通過(guò)用不同組成和濃度的玻璃化液在不同的預(yù)處理?xiàng)l件下對(duì)P2代成骨誘導(dǎo)cBMSCs復(fù)合pDBM常規(guī)構(gòu)建的TEB進(jìn)行玻璃化凍存，選出適宜的玻璃化液和預(yù)處理?xiàng)l件。以VS55作對(duì)

4、照，用新研制的玻璃化液分別玻璃化凍存TEB7天或3個(gè)月，觀察TEB經(jīng)玻璃化凍存后的細(xì)胞活性和成骨能力。 結(jié)果: 1. 采用Percoll密度梯度離心法可獲得純度較高的cBMNCs。在pDBM上接種cBMNCs適宜的密度是30×106/mL。通過(guò)P2代成骨誘導(dǎo)和未誘導(dǎo)cBMSCs復(fù)合pDBM常規(guī)構(gòu)建TEB與cBMNCs復(fù)合pDBM即刻構(gòu)建TEB的體外成骨培養(yǎng)檢測(cè)中發(fā)現(xiàn)盡管即刻構(gòu)建的TEB在相同的檢測(cè)時(shí)間內(nèi)細(xì)胞活性和成骨能力

5、較低，但隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)可具有很大的提升空間。 2. 用玻璃化液VS442在0℃/15分鐘的預(yù)處理?xiàng)l件下玻璃化凍存由P2代成骨誘導(dǎo)cBMSCs復(fù)合pDBM常規(guī)構(gòu)建的TEB可獲得較好的凍存效果。在與VS55的比較中，用VS442進(jìn)行TEB玻璃化凍存后的細(xì)胞活性和成骨能力明顯強(qiáng)于VS55，將玻璃化凍存時(shí)間從7天延長(zhǎng)至3個(gè)月時(shí)并未對(duì)細(xì)胞活性和成骨能力造成影響。 結(jié)論: 11.063g/mLPercoll液能夠較好的分