組織工程化骨的構建與玻璃化凍存的體外實驗研究.pdf

1、目的: 組織工程化骨(TEB)是目前骨缺損修復理想的骨移植材料之一，但常規(guī)的體外構建過程需要一段時間，無法滿足臨床上即刻骨缺損修復的要求。本研究針對這一問題進行了兩種解決方案的體外實驗研究。 1. 有實驗報道用骨髓單個核細胞(BMNCs)復合材料即刻構建的組織工程化骨進行體內骨缺損的即刻修復有一定的效果。但無體外實驗對此方案的成骨效果進行論證，為此本實驗通過在成骨誘導環(huán)境的體外檢測來對此方案進一步加以驗證。 2.

2、 常規(guī)構建的組織工程化骨若能獲得理想的深低溫保存效果則可作為實現(xiàn)即刻骨缺損修復的另一方案。玻璃化凍存是目前最有發(fā)展前景的凍存方法，因此本實驗進行體外檢測來驗證玻璃化凍存TEB的可行性。 方法: 1. 用1.063g/mLPercoll液分離Beagle犬骨髓單個核細胞(cBMNCS)。將豬股骨頭制備成直徑5毫米(mm)、厚度1mm的部分脫鈣骨(pDBM)支架材料。通過cBMNCs在pDBM上粘附率的檢測，獲得理想的細胞接

3、種密度。用此密度的cBMNCs分別經過誘導培養(yǎng)或常規(guī)培養(yǎng)的第二(P2)代成骨誘導或未誘導犬骨髓基質干細胞(cBMSCs)復合pDBM常規(guī)構建的TEB與該密度cBMNCs復合pDBM即刻構建的TEB共同進行成骨誘導培養(yǎng)，體外分析比較各自的細胞活性和成骨能力。 2. 通過用不同組成和濃度的玻璃化液在不同的預處理條件下對P2代成骨誘導cBMSCs復合pDBM常規(guī)構建的TEB進行玻璃化凍存，選出適宜的玻璃化液和預處理條件。以VS55作對

4、照，用新研制的玻璃化液分別玻璃化凍存TEB7天或3個月，觀察TEB經玻璃化凍存后的細胞活性和成骨能力。 結果: 1. 采用Percoll密度梯度離心法可獲得純度較高的cBMNCs。在pDBM上接種cBMNCs適宜的密度是30×106/mL。通過P2代成骨誘導和未誘導cBMSCs復合pDBM常規(guī)構建TEB與cBMNCs復合pDBM即刻構建TEB的體外成骨培養(yǎng)檢測中發(fā)現(xiàn)盡管即刻構建的TEB在相同的檢測時間內細胞活性和成骨能力

5、較低，但隨著培養(yǎng)時間的延長可具有很大的提升空間。 2. 用玻璃化液VS442在0℃/15分鐘的預處理條件下玻璃化凍存由P2代成骨誘導cBMSCs復合pDBM常規(guī)構建的TEB可獲得較好的凍存效果。在與VS55的比較中，用VS442進行TEB玻璃化凍存后的細胞活性和成骨能力明顯強于VS55，將玻璃化凍存時間從7天延長至3個月時并未對細胞活性和成骨能力造成影響。 結論: 11.063g/mLPercoll液能夠較好的分