6種miRNAs在人不同腫瘤細胞及組織中的表達差異及生物學意義.pdf

1、microRNAs(miRNAs)是一類長19～25個核苷酸，內源性非編碼的單鏈小分子RNA，在物種間高度保守。miRNAs參與腫瘤細胞的增殖、分化、凋亡及轉移過程，其突變、缺失及表達水平的異常與人類腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關。
　　 大量關于miRNAs表達水平改變的文獻報道，均是基于某一種腫瘤，檢測其miRNAs表達譜的改變。本研究中，目標miRNAs是通過查閱大量文獻，篩選出人類腫瘤相關miRNAs的信息，并加以對比和分析，

2、找出與人類腫瘤相關性較大，但目前研究得尚不透徹，因而具有潛在研究價值的miRNAs。本研究篩選出miR-100、miR-148a、miR-181a、miR-200a、miR-200c和miR-218等六種目標miRNAs。其中miR-100、miR-148a、miR-181a、和miR-218在多種腫瘤中表達水平下調，發(fā)揮抑癌基因的作用。miR-200a和miR-200c同屬miR-200家族，miR-200a在大多數腫瘤中表達下調，在

3、少部分腫瘤中表達上調，miR-200c在胰腺癌細胞和組織中抑制腫瘤侵襲，但促進腫瘤增殖。因此，關于miR-200a和miR-200c在眾多腫瘤中的表達情況，其發(fā)揮癌基因還是抑癌基因的作用，仍存在爭論，需進一步深入研究。此外，還有文獻報道，miR-148a、miR-200c與腫瘤耐藥有關，miR-218與乳頭瘤病毒有關。
　　 real-timePCR檢測miRNAs，是目前應用得最為廣泛的方法，其重復性好，需要的樣本量小且定量準

4、確。因此，本實驗將用real-time PCR法檢測目標miRNAs在不同來源、不同類型腫瘤細胞中的表達水平，并在肺癌及乳腺癌組織中進行驗證，比較表達差異、分析生物學意義。
　　 材料與方法：
　　 一、細胞及組織標本收集
　　 所有細胞株均為本實驗室保存，包括27株人腫瘤細胞，2株人正常上皮細胞。乳腺癌組織收集自中國醫(yī)科大學附屬第一、第四醫(yī)院乳腺外科，是2009年3月至2010年12月間手術切除、病理診斷明確的

5、10例乳腺癌及其相應的癌旁組織。肺癌組織收集自中國醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院胸外科，是2010年12月至2011年2月間手術切除、病理診斷明確的10例肺癌及其相應癌旁組織?；颊咝g前均未接受化療及放療。
　　 二、試劑和儀器
　　 miRNA提取試劑盒購自北京百泰克公司；RT-PCR試劑和real-timePCR試劑盒購自TAKARA公司。儀器有超凈工作臺、細胞培養(yǎng)箱、恒溫水浴箱、超微量核酸蛋白測定儀、PCR擴增儀、Mx3000

6、p Real-time PCR儀、顯微鏡等。
　　 三、方法
　　 通過查閱大量文獻，并經過對比分析，篩選出人類腫瘤相關的目標miRNAs，用real-timePCR法檢測其在人不同腫瘤細胞株中、人乳腺癌組織中、人肺癌組織中的表達水平。反轉錄的莖環(huán)引物由作者設計，并驗證特異性和靈敏度。采用目前較為公認的TargetScan、miRanda、PicTar等生物信息學軟件預測系統(tǒng)，預測目標miRNAs作用的靶mRNAs和可能

7、的生物學功能。
　　 結果：
　　 1、目標miRNAs在人不同腫瘤細胞中的表達差異
　　 1.1與人正常支氣管上皮細胞相比，肺癌細胞中miR-181a、miR-200a和miR-218的表達水平下調。
　　 1.2與人正常乳腺上皮細胞相比，乳腺癌細胞中miR-100、miR-148a、miR-181a、miR-200a、miR-200c和miR-218的表達水平均有所下調。
　　 1.3與乳腺癌

8、細胞MCF7相比，阿霉素耐藥株MCF7/ADR中miR-148a、miR-200a、和miR-218的表達水平分別升高了14.7倍，25.8倍和1438.1倍，但仍低于正常乳腺上皮細胞MCF10A。通過生物信息學預測系統(tǒng)，發(fā)現(xiàn)miR-200a和miR-218與乳腺癌耐藥蛋白BCRP的mRNA3'UTR區(qū)存在結合位點。
　　 1.4 miR-100和miR-181a在不同來源、不同類型腫瘤細胞中的表達水平平行相關。
　　

9、2、目標miRNAs在肺癌、乳腺癌及相應癌旁組織中的表達差異
　　 2.1目標miRNAs在肺癌及相應癌旁組織中的表達
　　 2.1.1在10例肺癌旁組織中，miR-181a、miR-200a和miR-218的平均表達水平為0.381，0.371，0.291;在相應的10例肺癌組織中，平均表達水平為0.342，0.345,0.112。。
　　 2.1.210對肺癌及癌旁組織中，miR-218在肺癌組織中的表達水平

10、低于相應的癌旁組織(9/10)，其他目標miRNAs表達水平未見差異
　　 2.2目標miRNAs在乳腺癌及其相應癌旁組織中的表達
　　 2.2.1在10例乳腺癌旁組織中，miR-100、miR-148a、miR-181a、miR-200a、miR-200c和miR-218的平均表達水平分別為1.705，0.747，1.302，0.710，0.899，和0.174;在相應的10例乳腺癌組織中，平均表達水平為0.336，0

11、.758，0.477，0.916,1.157,0.059。
　　 2.2.210對乳腺癌及癌旁組織中，miR-100(8/10)，miR-181a(6/10)和miR-218(7/10)在癌組織中的表達水平低于其相應的癌旁組織，其他目標miRNAs表達水平未見差異。
　　 3、目標miRNAs在腫瘤細胞及組織中表達水平的相關性分析
　　 3.1分析6種miRNAs在腫瘤細胞中的總體表達水平發(fā)現(xiàn)：miR-100和m

12、iR-181a在人腫瘤細胞中的總體表達水平較高，平均值分別為0.354和0.189;miR-148a、miR-200a、miR-200c和miR-218在人腫瘤細胞中的總體表達水平較低，平均值分別為0.039，0.050，0.082和0.029。
　　 3.2比較6種miRNAs在乳腺癌及其相應癌旁組織中的總體表達水平，發(fā)現(xiàn)在乳腺癌旁組織中miR-100和miR-181a的總體表達水平較高，說明其在癌旁組織中的表達基線原本較高；

13、miR-148a、miR-200a、miR-200c和miR-218的總體表達水平較低，尤以miR-218表達水平最低，說明其在癌旁組織中的表達基線原本較低。在乳腺癌組織中，miR-100和miR-181a與癌旁組織相比表達水平有所下調，但由于其在癌旁組織中的表達基線較高，仍然高于miR-148a、miR-200a、miR-200c和miR-218在乳腺癌及癌旁組織中的表達。其中miR-218在乳腺癌旁組織中的表達水平最低，在癌組織中又

14、進一步下降，因而遠低于miR-100和miR-181a。
　　 3.3目標miRNAs在腫瘤細胞及乳腺癌組織中總體表達水平差異及相關性：miR-100和miR-181a在乳腺癌旁組織中的基線水平較高，盡管在腫瘤細胞及乳腺癌組織中表達下降，但仍有較高的表達水平；miR-148a、miR-200a、miR-200c和miR-218在乳腺癌旁組織中的基線水平較低，所以在腫瘤細胞及乳腺癌組織中表達總體水平也較低，其中以miR-218低表

15、達最為明顯。
　　 結論：
　　 1、miR-218在肺癌細胞和組織中表達水平均下降。
　　 2、miR-100、miR-181a和miR-218在乳腺癌細胞和組織中表達水平均下降。
　　 3、miR-148a、miR-200a和miR-218在乳腺癌耐阿霉素細胞株中表達水平升高，但低于正常乳腺上皮細胞。miR-200a和miR-218與乳腺癌耐藥蛋白BCRP的編碼基因ABCG2的mRNA的3'UTR區(qū)存