ADAM10在膠質(zhì)瘤中的表達及生物學意義的研究.pdf

1、膠質(zhì)瘤是顱內(nèi)最常見的原發(fā)惡性腫瘤,呈浸潤性生長,腫瘤與正常腦組織之間無明顯界限,手術(shù)無法徹底治愈,患者均死于腫瘤的復發(fā)。目前認為無法治愈的根本因為在于膠質(zhì)瘤細胞的無限增殖和向周圍正常腦組織的侵襲生長。
　　 研究表明,有多種生物大分子參與膠質(zhì)瘤細胞的增殖和侵襲過程。這些大分子是鋅依賴性的具有蛋白水解酶功能的酶蛋白分子,包括去整合素-金屬蛋白酶(adisintegrin and metalloprotease,MMPs)家族、去整

2、合素一金屬蛋白酶(a disintegrinand metalloprotease,ADAMs)家族等,這些家族在結(jié)構(gòu)和功能上均有一些相似之處。ADAMs家族近年來成為研究的熱點。研究人員已經(jīng)發(fā)現(xiàn)ADAM12在不同級別膠質(zhì)瘤中存在表達差異,級別越高則表達越多；進一步研究發(fā)現(xiàn)ADAM12具有水解細胞外復合分子肝素結(jié)合性表皮生長因子(heparinbin-inding epidermal growth factor,HB-EGF)而產(chǎn)生活性

3、分子表皮生長因子(epidermal growth factor,EGF)的作用。正是通過水解產(chǎn)生的活性分子EGF與表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor,EGFR)結(jié)合,使細胞外信號傳遞到細胞內(nèi),激活控制膠質(zhì)瘤細胞增殖的相關(guān)基因完成調(diào)控作用。
　　 ADAM10作為ADAMs家族中的一員與其他成員有著相似的結(jié)構(gòu)和功能。已經(jīng)有研究證實ADAM10參與細胞上皮的更新,組織重建,細胞的粘連

4、。國外研究人員研究發(fā)現(xiàn)ADAM10在體外胃癌細胞中有過度表達,并證實ADAM10是通過EGFR配子脫落來促進癌細胞增殖。也有人發(fā)現(xiàn)其能夠水解細胞外Ⅳ型膠原,分析認為可能是通過水解Ⅳ型膠原促進癌細胞向遠處侵襲生長。ADAM10在膠質(zhì)瘤中的表達情況及是否參與癌細胞的增殖目前仍不是很清楚。
　　 本課題擬將臨床不同級別膠質(zhì)瘤依照世界衛(wèi)生組織(world health organization,WHO)標準分為低級別和高級別兩組,以腦膜

5、瘤作為對照組,應(yīng)用反轉(zhuǎn)錄多聚酶鏈式反應(yīng)(reverse transcripase polymerase chain reaction,RT-PCR)對三組ADAM10基因表達進行檢測,并比較表達差異。利用鏈霉親合素-生物素-過氧化物酶免疫組織化學方法(StreptAvidin-BiotinComplex,SABC)檢測ADAM10蛋白表達及分布,表達情況及分布進行分析,探索其可能的作用機制。本實驗的目的就是為膠質(zhì)瘤的靶向治療尋找靶點并提

6、供實驗基礎(chǔ)。
　　 材料與方法：
　　 一、實驗標本的獲取
　　 取我院2007-2010年共計43例腦膠質(zhì)瘤患者標本,低級別膠質(zhì)瘤22例,高級別膠質(zhì)瘤21例,取腦膜瘤10例作為對照組。所有標本均于腫瘤中心采取,立即置于-70℃保存,并保留病例信息。所有標本均經(jīng)過病理學核實。
　　 二、實驗方法
　　 (一)腫瘤組織RNA的提取
　　 按照TaKaRa公司說明利用RNAiso Plus從組

7、織標本中提取RNA。取100mg-70℃保存的瘤組織剪成勻漿狀,立即放入1.5ml去RNA酶的EP管中加入1mlRNAiso Plus,室溫靜置5分鐘,取上清加入0.2ml氯仿,靜置后離心,取上清后加入異丙醇靜置后再離心可見白色片狀物,干燥后加入40ul去RNA酶水溶解用紫外分光光度儀測RNA純度及含量。
　　 (二)兩步法RT-PCR:
　　 引物序列參考文獻由TaKaRa公司合成,上下游序列分別為5'-TGGGTCA

8、AAAAGAAAATGGC-3,和5'-CCCAGGTTTCAGTTTGCATT-3’。擴增片段長度為281bp,采用β-actin為內(nèi)參對照,上游:5'-AAATCGTGCGTGACATTAA-3’,下游:5'-CTCG TCATACTCCTGCCTG-3’擴增片段大小為474 bp。RT體系為10ul,取2.5ul模板(cDNA)進行擴增。PCR體系在94℃下變性2分鐘,循環(huán)條件為94℃30秒,55℃30秒,72℃2分鐘,共30個循

9、環(huán),最后延伸10分鐘。取產(chǎn)物8ul通過電泳利用瓊脂糖凝膠進行分離,并在紫外線燈下照相。最后通過凝膠灰度分析儀進行統(tǒng)計分析。
　　 (三)免疫組織化學染色
　　 按照SABC染色試劑盒說明進行操作,結(jié)果判斷:在光鏡下有棕黃色顆粒反應(yīng)出現(xiàn)在細胞膜、細胞質(zhì)均為陽性反應(yīng)細胞,于5個不同高倍視野相同范圍下計數(shù)500個細胞及免疫組化染色陽性細胞數(shù),陽性細胞率<5％記為(-),5％-50％為(+),50％-75％為(++),>75％為

10、(+++)。統(tǒng)計學處理。
　　 利用SPSS14.0軟件對結(jié)果進行數(shù)據(jù)分析。不同組間參數(shù)比較利用One-wayANOVA分析,p<0.05具有統(tǒng)計學意義。
　　 結(jié)果：
　　 一、ADAM10基因mRNA的表達
　　 對三組共63個條帶灰度掃描,平均灰度值提示高級別組ADAM10基因表達最多,對照組略有表達。平均灰度單因素方差分析提示高級別組和低級別組比較具有顯著性差異(t=13.31,p<0.05)；低

11、級別組與對照組比較差異明顯(t=22.83,p<0.01)。
　　 二、ADAM10蛋白的表達
　　 對照組高倍鏡下可見47個陽性細胞(9.4％),低級別組可見269個陽性細胞(53.8％),高級別組可見382個陽性細胞(76.4％)。ADAM10蛋白免疫組化染色顯示對照組中可以看到稀少陽性染色細胞；低級別組中可以看到很多瘤細胞結(jié)構(gòu)已經(jīng)破壞,呈空泡狀,背景呈現(xiàn)非特異染色?？梢钥吹缴⒃诘牧黾毎ど虾桶|(zhì)部分陽性染色；高級