考布他汀A4磷酸酯通過Notch-1-Snail克服非小細(xì)胞肺癌吉非替尼耐藥的研究.pdf

1、肺癌是全世界發(fā)病率及死亡率最高的惡性腫瘤之一，其中80％以上為非小細(xì)胞肺癌（Non-Small Cell Lung Cancer，NSCLC）。吉非替尼（Gefitinib，Gef）是NSCLC治療中的第一個(gè)分子靶向藥物，具有特異性強(qiáng)，耐受性好，不良反應(yīng)少的優(yōu)點(diǎn)。但多數(shù)患者在治療數(shù)月后會(huì)產(chǎn)生獲得性耐藥，導(dǎo)致病情惡化。因此，探討產(chǎn)生Gef獲得性耐藥的機(jī)制并尋求新的治療策略是目前NSCLC治療領(lǐng)域中亟待解決的關(guān)鍵問題。
　　研究顯示，

2、Notch-1信號(hào)通路與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及耐藥性密切相關(guān)，其可通過上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（Epithelial-Mesenchymal Transition，EMT）這一途徑影響腫瘤的多藥耐藥?？疾妓4磷酸酯（Combretastatins A4 phosphate，CA4P）為考布他汀A4（Combretastatins A4，CA4）的水溶性磷酸鹽前體藥物，可通過干擾微管蛋白的聚集，選擇性地靶向破壞腫瘤血管結(jié)構(gòu)的完整性，從而產(chǎn)生抗腫瘤效

3、應(yīng)，目前CA4P已進(jìn)入腫瘤治療的臨床試驗(yàn)階段。
　　本研究旨在探討CA4P聯(lián)合Gef對(duì)NSCLC的增殖、凋亡、細(xì)胞周期、遷移的作用以及兩藥聯(lián)合能否通過抑制 Notch-1/Snail信號(hào)通路逆轉(zhuǎn) EMT，增加NSCLC對(duì)Gef的敏感性，為克服NSCLC治療中Gef的耐藥問題提供新的治療策略。本研究分為以下兩個(gè)部分：
　　第一部分
　　目的：探討CA4P與Gef聯(lián)用對(duì)H1975細(xì)胞的增殖、凋亡、細(xì)胞周期及遷移的作用。

4、r>　　方法：CA4P、Gef單用或兩藥按不同方式合用，作用于T790M突變耐藥的H1975細(xì)胞，觀察細(xì)胞的形態(tài)特征；MTT法檢測(cè)CA4P、Gef單用或兩藥合用對(duì)細(xì)胞的增殖抑制作用，并計(jì)算其聯(lián)合指數(shù)（Combination index，CI），評(píng)價(jià)不同給藥方式產(chǎn)生的效果；流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)凋亡率和細(xì)胞周期；劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞的遷移能力。
　　結(jié)果：采取不同方式給藥以評(píng)價(jià)兩藥的聯(lián)合效應(yīng)。結(jié)果顯示，與Gef單用組相比，CA4P+Gef組耐藥

5、逆轉(zhuǎn)倍數(shù)約為155倍，且協(xié)同指數(shù)最?。–I<1），說明兩藥合用的效果受序貫或聯(lián)合不同給藥方式的影響，以CA4P+Gef聯(lián)合用藥的方式協(xié)同作用最強(qiáng)。鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，H1975細(xì)胞形態(tài)多數(shù)呈不規(guī)則梭型，細(xì)胞間緊密連接，CA4P、Gef單藥及兩藥聯(lián)合后，細(xì)胞形態(tài)多由不規(guī)則梭型變成形態(tài)規(guī)則的多邊形，細(xì)胞數(shù)量也明顯減少，說明CA4P、Gef單藥及兩藥聯(lián)合均能抑制H1975細(xì)胞生長(zhǎng)，且兩藥聯(lián)合組的抑制效果強(qiáng)于單藥組。檢測(cè)細(xì)胞的凋亡率結(jié)果顯示，與對(duì)照組

6、相比，Gef單用組細(xì)胞凋亡率無明顯變化，CA4P單用組細(xì)胞凋亡率顯著升高（P＜0.01）；與CA4P、Gef組相比，CA4P+Gef組細(xì)胞凋亡率均有顯著性升高（P＜0.01），表明CA4P聯(lián)合Gef可協(xié)同促進(jìn)H1975細(xì)胞凋亡。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，Gef單用組各細(xì)胞周期中的細(xì)胞比例無顯著變化，而CA4P單用組G0/G1期、S期細(xì)胞比例顯著降低，G2/M期細(xì)胞比例顯著升高（P＜0.01）；與CA4P、Gef單用組

7、相比，CA4P+Gef聯(lián)合組G0/G1期、S期比例降低，G2/M期比例升高（P＜0.01），說明單用Gef對(duì)H1975細(xì)胞周期無明顯影響，CA4P聯(lián)合Gef可顯著誘導(dǎo)H1975細(xì)胞周期阻滯于G2/M期。劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，CA4P、Gef單用組細(xì)胞遷移率顯著降低（P＜0.05，P＜0.01）；與CA4P、Gef組相比，CA4P+ Gef組細(xì)胞遷移率進(jìn)一步降低（P＜0.01），說明兩藥聯(lián)合可協(xié)同抑制H1975細(xì)胞的遷移能力。<

8、br>　　結(jié)論： CA4P與Gef聯(lián)合用藥可協(xié)同抑制H1975細(xì)胞的增殖、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、阻滯細(xì)胞周期并抑制其遷移能力。
　　第二部分
　　目的：探討CA4P聯(lián)合Gef對(duì)H1975細(xì)胞Notch-1與Snail蛋白表達(dá)的影響，為克服NSCLC治療中的Gef耐藥提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　方法：取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的H1975細(xì)胞，分別用CA4P10nM、Gef2μM及CA4P10nM+Gef2μM孵育細(xì)胞48h，采用Western bl

9、otting法檢測(cè)H1975細(xì)胞Notch-1、Snail蛋白表達(dá)。
　　結(jié)果：與對(duì)照組比較，Gef組Notch-1與Snail蛋白的表達(dá)無明顯變化，CA4P組、CA4P+Gef組的Notch-1與Snail蛋白表達(dá)均明顯降低（P＜0.01），CA4P+Gef組與CA4P、Gef組比較，Notch-1與Snail蛋白表達(dá)明顯降低（P＜0.01）。
　　結(jié)論：CA4P聯(lián)合Gef可降低Notch-1與Snail蛋白表達(dá)水平，提示