DHA增強(qiáng)吉非替尼對EGFR基因突變的非小細(xì)胞肺癌的抗瘤作用.pdf

1、肺癌是當(dāng)前世界范圍內(nèi)發(fā)病率最高的惡性腫瘤，近50年來肺癌的發(fā)病率在持續(xù)顯著增加，而且肺癌死亡率已經(jīng)高居我國惡性腫瘤死亡率排行的榜首。肺癌成為危害生命健康的一種主要疾病。非小細(xì)胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)是肺癌的主要病理類型之一，占肺癌的80％，也是我國肺癌的主要病理類型。肺癌在起病早中期多無特異的臨床癥狀，大部分的肺癌在發(fā)現(xiàn)時(shí)已經(jīng)喪失了手術(shù)治療的機(jī)會，而且雖然手術(shù)、化療、放療技術(shù)在不斷提高，

2、但非小細(xì)胞肺癌患者的預(yù)后仍然很差，這也是肺癌高死亡率的重要原因。伴隨著分子遺傳學(xué)研究的不斷進(jìn)展，針對癌基因突變的分子靶向治療已經(jīng)成為進(jìn)展期非小細(xì)胞肺癌治療的重要手段。吉非替尼作為代表性的表皮生長因子受體酪氨酸激酶抑制劑(EGFR-TKI)，是肺癌分子靶向治療藥物中的突出代表。吉非替尼與表皮生長因子受體(EGFR)的腺嘌呤核苷三磷酸(ATP)激酶結(jié)合位點(diǎn)上的三磷酸腺苷競爭，阻斷其酪氨酸激酶活性，影響EGFR的信號傳導(dǎo)通路，從而影響肺癌細(xì)胞

3、的生長。相較于傳統(tǒng)意義上的放化療，吉非替尼對于表皮生長因子受體突變的非小細(xì)胞肺癌有著更好的療效和安全性。在2003年吉非替尼通過了美國食品藥品管理局(FDA)認(rèn)證用于治療EGFR突變的非小細(xì)胞肺癌。2011年中國版非小細(xì)胞肺癌實(shí)踐指南將吉非替尼列為了EGFR突變的非小細(xì)胞肺癌的一線治療藥物。
　　多不飽和脂肪酸(PUFA)指含有兩個(gè)或兩個(gè)以上雙鍵且碳鏈長度為18～22個(gè)碳原子的直鏈脂肪酸。根據(jù)多不飽和脂肪酸中第一個(gè)不飽和鍵出現(xiàn)在碳

4、鏈甲基端的位置，通常分為N-3多不飽和脂肪酸（第一個(gè)不飽和鍵出現(xiàn)在碳鏈甲基端的第三位）和N-6多不飽和脂肪酸（第一個(gè)不飽和鍵出現(xiàn)在碳鏈甲基端的第六位）。DHA(docosahexaenoic acid，DHA)，二十二碳六烯酸，屬于N-3多不飽和脂肪酸家族中的重要成員。近年來研究顯示DHA對人類健康有很大益處，DHA可以預(yù)防和治療很多慢性疾病，包括心血管疾病、炎癥反應(yīng)、神經(jīng)退行性病變等等。流行病學(xué)研究發(fā)現(xiàn)在飲食中富含DHA的沿海區(qū)域，腫

5、瘤的發(fā)生發(fā)展水平更低。近期的一些體外及體內(nèi)試驗(yàn)顯示以DHA為代表的N-3多不飽和脂肪酸有顯著的抗腫瘤作用，細(xì)胞學(xué)試驗(yàn)和動物學(xué)試驗(yàn)已經(jīng)證實(shí)了DHA可以抑制肺癌細(xì)胞的增殖。一些研究還發(fā)現(xiàn)N-3多不飽和脂肪酸可以增強(qiáng)一些化療藥物的抗腫瘤活性。
　　DHA對于EGFR基因突變的非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞和無EGFR基因突變的非小細(xì)胞肺癌增殖有無差異影響，DHA對于吉非替尼的抗肺癌細(xì)胞作用有無影響，若DHA和吉非替尼對肺癌細(xì)胞能起到協(xié)同抑制作用，作用

6、的機(jī)制可能是什么，這些情況目前尚無報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)中，我們選取了兩類非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞:EGFR基因突變的PC9細(xì)胞和無EGFR基因突變即EGFR基因野生型的A549細(xì)胞。試驗(yàn)通過一系列梯度濃度和作用時(shí)間的DHA和吉非替尼比較其對PC9細(xì)胞和A549細(xì)胞的活力及增殖能力的影響;通過DHA和吉非替尼單獨(dú)或聯(lián)合治療比較其對EGFR基因突變和野生型非小細(xì)胞肺癌凋亡和細(xì)胞周期的影響;通過Western免疫印跡技術(shù)了解磷酸化和非磷酸化EGFR and

7、ERK1/2的水平，了解其對信號通路的影響來揭示部分作用機(jī)制。旨在探討DHA可否作為營養(yǎng)干預(yù)手段增強(qiáng)靶向治療藥物吉非替尼對非小細(xì)胞肺癌的治療作用。
　　研究目的:
　　我們本次研究的目的旨在探討DHA和吉非替尼對EGFR基因突變的非小細(xì)胞肺癌的影響。細(xì)胞的活力及增殖能力、細(xì)胞凋亡、細(xì)胞核形態(tài)、細(xì)胞周期以及表皮生長因子受體磷酸化水平均包含于我們的研究內(nèi)容中，以了解兩種藥物之間有無協(xié)同或拮抗作用，及其可能的作用機(jī)制。
　　

8、研究材料與方法:
　　本實(shí)驗(yàn)中我們選取了兩類非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞:EGFR突變的PC9細(xì)胞系(EGFR基因的19外顯子缺失，E746-A750型)和含有野生型EGFR的A549細(xì)胞系。細(xì)胞的培育使用的是DMEM/F12培養(yǎng)基，培養(yǎng)24至72小時(shí)。待細(xì)胞在培養(yǎng)皿中生長達(dá)到80％-90％滿時(shí)，取出培養(yǎng)皿，使用0.25％胰蛋白酶消化處理后，進(jìn)行傳代培養(yǎng)（1∶3進(jìn)行傳代）。
　　分別選擇濃度梯度和時(shí)間梯度的DHA和吉非替尼作用于PC9細(xì)

9、胞和A549細(xì)胞，MTT法分析DHA和/或吉非替尼對兩種細(xì)胞活力的影響?？寺⌒纬蓪?shí)驗(yàn)分析DHA和/或吉非替尼對兩細(xì)胞系增殖的影響。流式細(xì)胞術(shù)分析DHA和吉非替尼單藥治療、聯(lián)合治療對兩種非小細(xì)胞肺癌的凋亡影響，熒光顯微鏡觀察細(xì)胞核形態(tài)變化。通過流式細(xì)胞分析儀檢測DHA和吉非替尼單藥治療、聯(lián)合治療對兩種非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞周期的影響。通過Western blot檢測了解DHA和吉非替尼單藥治療、聯(lián)合治療對兩種非小細(xì)胞肺癌磷酸化和非磷酸化EGFR

10、and ERK1/2水平的影響。試驗(yàn)步驟均重復(fù)進(jìn)行三次，將重復(fù)三次的實(shí)驗(yàn)結(jié)果計(jì)算平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。應(yīng)用GraphPad Prism5.0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。其中，計(jì)量資料應(yīng)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）來表示，采用單因素方差分析進(jìn)行多組數(shù)據(jù)差異比較。P＜0.05和＜0.01均認(rèn)為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　研究結(jié)果:
　　1.MTT檢測證實(shí)DHA與吉非替尼均以濃度及時(shí)間依賴方式抑制突變型的PC9細(xì)胞及野生型的A549細(xì)胞的活力。根據(jù)細(xì)胞生長抑制

11、率的不同，我們使用100μg/ml的DHA溶液聯(lián)合60nmol/L的吉非替尼溶液處理PC9細(xì)胞，同時(shí)使用100μg/ml的DHA溶液聯(lián)合15μmol/L的吉非替尼溶液處理A549細(xì)胞。DHA和吉非替尼聯(lián)合用藥對細(xì)胞活力抑制起協(xié)同作用，即DHA增加吉非替尼對PC9細(xì)胞及A549細(xì)胞的活力抑制。
　　2.克隆形成實(shí)驗(yàn)顯示DHA和吉非替尼均以濃度和時(shí)間依賴方式抑制EGFR基因突變的PC9細(xì)胞和EGFR基因野生型的A549細(xì)胞增殖。經(jīng)過o

12、ne-way ANOVA分析及Newman-Keuls多重比較檢驗(yàn)后我們發(fā)現(xiàn)，無論是兩個(gè)單一用藥組，還是聯(lián)合用藥組，其對PC9細(xì)胞和A549細(xì)胞克隆形成的抑制作用與對照組相比均是增強(qiáng)的，且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P值＜0.01。同時(shí)，將聯(lián)合用藥組的結(jié)果與單獨(dú)使用DHA和吉非替尼的實(shí)驗(yàn)組相比較，聯(lián)合用藥組的克隆形成抑制作用也明顯強(qiáng)于單一用藥組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P值＜0.01。
　　3.對于PC9細(xì)胞，與對照組相比，DHA和吉非替尼在單一

13、用藥時(shí)和聯(lián)合用藥時(shí)對于絀胞凋亡的促進(jìn)作用都具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P值均＜0.01;而且DHA與吉非替尼聯(lián)合用藥組與單獨(dú)使用DHA或吉非替尼處理的實(shí)驗(yàn)組相比，其對PC9細(xì)胞凋亡的促進(jìn)作用也具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P值均＜0.01。對于A549細(xì)胞，各個(gè)實(shí)驗(yàn)組凋亡百分比與對照組相比差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P值均＞0.05;聯(lián)合用藥組與兩個(gè)單一用藥組相比差異也沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P值均＞0.05。DHA和吉非替尼單藥及聯(lián)合治療對A549細(xì)胞的凋亡均沒有明顯影響。<

14、br>　　4.通過DAPI染色和熒光顯微鏡觀察細(xì)胞核形態(tài)，我們發(fā)現(xiàn)單獨(dú)應(yīng)用DHA或吉非替尼或者聯(lián)合用藥對于PC9細(xì)胞核都有影響，而DHA聯(lián)合吉非替尼對PC9細(xì)胞的細(xì)胞核影響最大，包括核形態(tài)的改變，異形核數(shù)量的增多，核密度改變等。這一結(jié)果反映出聯(lián)合用藥對于PC9細(xì)胞的凋亡有明顯影響，這與流式細(xì)胞儀檢測到的細(xì)胞凋亡結(jié)果是一致的。而對于A549細(xì)胞，無論是單獨(dú)應(yīng)用DHA或吉非替尼，還是聯(lián)合應(yīng)用兩種藥物，細(xì)胞核形態(tài)和密度改變都不明顯，這一結(jié)果也

15、進(jìn)一步印證了流式細(xì)胞儀檢測觀察到的A549細(xì)胞凋亡情況。
　　5.通過流式細(xì)胞儀檢測經(jīng)過藥物處理的突變型PC9細(xì)胞和野生型A549細(xì)胞，我們發(fā)現(xiàn)DHA和吉非替尼對兩種細(xì)胞的細(xì)胞周期都存在一定的影響。使用DHA和/或吉非替尼處理PC9細(xì)胞，結(jié)果顯示無論是單一用藥還是聯(lián)合用藥都會延長PC9細(xì)胞的G0G1期和G2M期，同時(shí)會縮短細(xì)胞的S期。而聯(lián)合用藥比單藥更加有效得延長PC9細(xì)胞的G0G1期。使用DHA和/或吉非替尼處理A549細(xì)胞，結(jié)

16、果顯示無論是單獨(dú)應(yīng)用DHA或吉非替尼，或者聯(lián)合應(yīng)用兩種藥物都能夠有效延長A549細(xì)胞得G0G1期。同時(shí)還能夠有效縮短細(xì)胞的S期，且聯(lián)合用藥對于S期的縮短效果明顯強(qiáng)于單獨(dú)應(yīng)用DHA或吉非替尼。
　　吉非替尼和DHA對PC9及A549細(xì)胞周期影響趨勢一致，均增加G0/G1期細(xì)胞比例，降低S期細(xì)胞比例。相比于單藥治療，聯(lián)合用藥在增加PC9細(xì)胞G0/G1期比例和減低A549細(xì)胞S期比例方面具備統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　6.免

17、疫印跡分析顯示DHA能夠明顯抑制PC9細(xì)胞的ERK1/2的磷酸化，而在A549細(xì)胞中，DHA則是促進(jìn)了EGFR的磷酸化，同時(shí)明顯抑制ERK1/2的磷酸化;吉非替尼能夠明顯抑制PC9細(xì)胞和A549細(xì)胞中EGFR和ERK1/2的磷酸化;當(dāng)DHA與吉非替尼聯(lián)合使用時(shí)，在PC9細(xì)胞和A549細(xì)胞中都能夠明顯抑制EGFR和ERK1/2的磷酸化，對于PC9細(xì)胞ERK1/2磷酸化的抑制效果明顯強(qiáng)于單獨(dú)應(yīng)用DHA或吉非替尼處理細(xì)胞時(shí)，對于A549細(xì)胞，