姜黃素聯(lián)合吉非替尼對(duì)非小細(xì)胞肺癌NCI-H1975作用及機(jī)制研究.pdf

1、研究目的:研究姜黃素聯(lián)合吉非替尼對(duì)人非小細(xì)胞肺癌NCI-H1975細(xì)胞耐藥性，以及增殖克隆、凋亡的影響，并進(jìn)一步探討其可能的分子機(jī)制。
　　研究方法:通過早期實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)吉非替尼對(duì)NCI-H1975細(xì)胞的IC50為8μmol/L，姜黃素對(duì)NCI-H1975細(xì)胞的IC15為10ng/ml。以不同濃度的吉非替尼(2、4、6、8、10)mol/L單獨(dú)或聯(lián)合10ng/ml姜黃素處理細(xì)胞，設(shè)立不給藥作為空白對(duì)照組，每個(gè)處理組分別設(shè)3個(gè)復(fù)孔，培

2、養(yǎng)24小時(shí)后采用四甲基偶氮唑(MTT)比色法檢測(cè)姜黃素聯(lián)合吉非替尼對(duì)吉非替尼抑制NCI-H1975細(xì)胞增殖抑制的影響。同時(shí)，分別以IC15濃度的姜黃素10ng/ml、IC50濃度的吉非替尼8μmol/L、及兩藥聯(lián)用（姜黃素10ng/ml+吉非替尼8μmol/）處理細(xì)胞，設(shè)立不給藥為空白對(duì)照，利用AnnexinⅤ/PI雙染法流式細(xì)胞儀檢測(cè)兩藥單獨(dú)及聯(lián)合處理后對(duì)NCI-H1975細(xì)胞凋亡的影響;用蛋白質(zhì)印跡法(Western Blottin

3、g)檢測(cè)MAPK途徑中的P-P38、P-ERK1/2、P-NF-κB，PI3K/AKT途徑中的P-AKT蛋白表達(dá);通過集落形成實(shí)驗(yàn)計(jì)數(shù)克隆集落數(shù)的方法，研究姜黃素、吉非替尼單獨(dú)及聯(lián)合處理NCI-H1975細(xì)胞后細(xì)胞的克隆形成能力;用鼠抗人抗P-gp-FITC單克隆抗體對(duì)姜黃素、吉非替尼單獨(dú)及聯(lián)合藥物處理后的細(xì)胞進(jìn)行染色，流式細(xì)胞儀上機(jī)檢測(cè)細(xì)胞膜表面P糖蛋白的表達(dá)。
　　研究結(jié)果:1.MTT法檢測(cè)不同濃度的吉非替尼(2、4、6、8、

4、10)μmol/L單獨(dú)或聯(lián)合10ng/ml姜黃素處理細(xì)胞，同時(shí)設(shè)立不給藥作為空白對(duì)照組，每個(gè)處理組分別設(shè)3個(gè)復(fù)孔。分析結(jié)果顯示，藥物處理24h后，姜黃素與吉非替尼聯(lián)合用藥較單用吉非替尼在各濃度上(2、4、6、8、10μmol/L)均可提高吉非替尼對(duì)NCI-H1975細(xì)胞的增殖抑制作用(p＜0.05);10ng/ml姜黃素聯(lián)合吉非替尼可降低吉非替尼的半數(shù)抑制濃度IC50（1.98±0.67μmol/L VS8.15±2.31μmol/L）

5、，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.05)。
　　2.利用AnnexinⅤ/PI雙染法流式細(xì)胞儀檢測(cè)以10ng/ml濃度的姜黃素、8μmol/L濃度的吉非替尼及兩藥聯(lián)用（姜黃素10ng/ml+吉非替尼8μmol/）對(duì)NCI-H1975細(xì)胞作用24小時(shí)后細(xì)胞的凋亡率，同時(shí)設(shè)立不給藥作為空白對(duì)照組?？瞻捉M、姜黃素、吉非替尼及兩藥聯(lián)用早期凋亡率分別為2.94±1.44％、3.48±2.18％、14.31±4.96％、41.09±9.82％，流

6、式細(xì)胞檢測(cè)結(jié)果顯示NCI-H1975細(xì)胞在姜黃素、吉非替尼的聯(lián)合作用下，較單用吉非替尼呈現(xiàn)出對(duì)腫瘤細(xì)胞更為明顯的凋亡誘導(dǎo)效應(yīng)(p＜0.05)，提示姜黃素可以促進(jìn)吉非替尼體外誘導(dǎo)NCI-H1975的凋亡。
　　3.分別用10ng/ml濃度的姜黃素、8μmol/L濃度的吉非替尼及兩藥聯(lián)用(姜黃素10ng/ml+吉非替尼8μmol/)對(duì)NCI-H1975細(xì)胞作用24小時(shí)后，Western Blotting法檢測(cè)EGFR下游MAPK途徑中

7、的P-P38、P-ERK1/2、P-NF-κB以及PI3K/AKT途徑中的P-AKT蛋白表達(dá)水平。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，姜黃素聯(lián)合吉非替尼較單用吉非替尼或單用姜黃素可更顯著抑制P38、ERK1/2、NF-κB、AKT的磷酸化水平。
　　4.分別以10ng/ml濃度的姜黃素、8μmol/L濃度的吉非替尼及兩藥聯(lián)用（姜黃素10ng/ml+吉非替尼8μmol/）處理培養(yǎng)于甲基纖維素半固體培養(yǎng)皿中對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的NCI-H1975細(xì)胞，CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)1

8、0天后，倒置顯微鏡下計(jì)數(shù)＞30個(gè)細(xì)胞的集落，計(jì)算克隆集落數(shù)，結(jié)果顯示姜黃素(10ng/ml)+吉非替尼（8μmol/L）聯(lián)合作用，較單用吉非替尼(8μmol/L)呈現(xiàn)出對(duì)腫瘤細(xì)胞克隆形成更為明顯的抑制效應(yīng)(p＜0.05)，提示姜黃素可以提高吉非替尼對(duì)NCI-H1975克隆形成能力的抑制作用。
　　5.分別以姜黃素10ng/ml、吉非替尼8μmol/L，及姜黃素10ng/ml+吉非替尼8μmol/L對(duì)腫瘤細(xì)胞NCI-H1975作用2

9、4小時(shí)，同時(shí)設(shè)立不加藥為空白對(duì)照組，用鼠抗人抗P-gp-FITC單克隆抗體對(duì)藥物處理后的細(xì)胞進(jìn)行染色，然后流式細(xì)胞儀上機(jī)檢測(cè)P糖蛋白(P-glycoproein，P-gp)，結(jié)果顯示單用姜黃素組及兩藥聯(lián)用組P糖蛋白表達(dá)明顯低于空白組(p＜0.05)，提示姜黃素可下調(diào)P糖蛋白表達(dá)
　　研究結(jié)論:1.姜黃素可顯著降低NCI-H1975對(duì)吉非替尼的IC50，姜黃素降低NCI-H1975耐藥性可能與降低腫瘤細(xì)胞表面P糖蛋白有關(guān)。