非同源末端連接修復(fù)信號(hào)通路在幽門螺桿菌致病中的初步研究.pdf

1、研究背景和目的:
　　幽門螺桿菌(Helicobacter pylori, Hp)是一種常見的、定植于胃黏膜的革蘭陰性桿菌,與許多胃腸道疾病發(fā)病密切相關(guān),目前普遍認(rèn)為在慢性胃炎—腸上皮化—異型增生—胃癌這一演變模型中,Hp感染起著先導(dǎo)作用,因此,1994年國(guó)際抗癌聯(lián)盟(UICC)將Hp列為I類致癌因子。最近國(guó)外有研究報(bào)道,Hp可誘導(dǎo)胃黏膜上皮細(xì)胞發(fā)生DNA雙鏈斷裂(Double-strand breaks,DSBs);DSBs是D

2、NA損傷最嚴(yán)重的一種形式,其修復(fù)機(jī)制較其他DNA損傷類型亦更為復(fù)雜。DSBs發(fā)生后可觸發(fā)機(jī)體的DNA損傷反應(yīng)(DNA damage response,DDR),DSBs對(duì)于細(xì)胞是嚴(yán)重的威脅,如果不能修復(fù)或錯(cuò)誤修復(fù)將導(dǎo)致突變或染色質(zhì)重排,最終可能導(dǎo)致腫瘤發(fā)生或細(xì)胞死亡。
　　在哺乳動(dòng)物細(xì)胞, DSBs主要通過(guò)非同源末端連接(non-homologous DNA ending joining, NHEJ)和同源連接(homologou

3、s recombination, HR)兩種途徑修復(fù)。NHEJ不需要序列同源而能夠直接端對(duì)端地重連接斷裂的DNA末端,在整個(gè)細(xì)胞周期都發(fā)揮作用,但主要是在G0和G1期對(duì)DSBs進(jìn)行修復(fù),對(duì)保持基因組的完整性十分重要。NHEJ修復(fù)通路涉及一系列的信號(hào)通路和功能蛋白,主要包括DSBs反應(yīng)感受器DNA-PK復(fù)合物(包括DNA-PKcs、Ku70/80二聚體)的激活,轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白介導(dǎo)信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng)(Artemis、XRCC4)以及效應(yīng)器發(fā)揮損傷修復(fù)功

4、能(DNA連接酶IV、XLF)等。NHEJ通路通常被認(rèn)為是參與調(diào)控細(xì)胞致死性損傷的主要途徑。然而,目前關(guān)于Hp是否對(duì)胃黏膜細(xì)胞損傷后NHEJ修復(fù)機(jī)制產(chǎn)生影響尚無(wú)研究,因此,探討Hp感染正常胃粘膜是否打破細(xì)胞正常NHEJ信號(hào)通路平衡,從而導(dǎo)致增值、凋亡紊亂參與疾病發(fā)生,可進(jìn)一步闡明Hp的致病機(jī)制,為Hp感染相關(guān)性疾病防治策略的制定提供新的理論和依據(jù)。
　　研究方法:
　　1、收集Hp陽(yáng)性和陰性的正常胃黏膜(共34例,其中Hp陽(yáng)

5、性18例和陰性16例)、胃癌病理標(biāo)本(共146例,其中Hp陽(yáng)性57例和陰性89例),免疫組織化學(xué)法檢測(cè)DNA-PKcs和Ku70/80蛋白的表達(dá)。
　　2、按MOI=100使用ATCC43504 Hp標(biāo)準(zhǔn)菌株分別作用于GES-1和AGS細(xì)胞,同時(shí)以同體積細(xì)胞培養(yǎng)液作用的GES-1和AGS細(xì)胞作為對(duì)照組,1、3、6、12和24h后提取總蛋白,Western blot檢測(cè)NHEJ信號(hào)通路相關(guān)蛋白DNA-PKcs和Ku70/80的表達(dá)。

6、
　　3、采用ATCC43504 Hp標(biāo)準(zhǔn)菌株懸液灌胃蒙古沙鼠,第6、12個(gè)月處死動(dòng)物,收集胃組織,免疫組化法檢測(cè)胃黏膜組織DNA-PKcs和Ku70/80蛋白表達(dá)。
　　研究結(jié)果:
　　1、人胃癌組織中NHEJ信號(hào)通路相關(guān)蛋白DNA-PKcs和Ku70/80的變化及其與Hp感染的關(guān)系
　　(1)DNA-PKcs蛋白在胃癌組織中的表達(dá)水平顯著高于正常胃黏膜組織(p<0.05)。實(shí)際上,DNA-PKcs在正常胃黏膜

7、組織中幾乎不表達(dá),在正常組的陽(yáng)性表達(dá)率為0％(0/34),在胃癌組其陽(yáng)性表達(dá)率為93.8%(137/146),兩組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.05)。此外,胃癌組DNA-PKcs蛋白表達(dá)的平均免疫組化得分顯著高于正常組(p<0.05)。將正常組和胃癌組標(biāo)本按Hp陽(yáng)性和陰性分兩組,比較各組中 Hp陽(yáng)性和陰性組間 DNA-PKcs蛋白的表達(dá)差異,結(jié)果發(fā)現(xiàn)DNA-PKcs蛋白表達(dá)在各組的Hp陽(yáng)性和陰性組間均無(wú)顯著性差異(p>0.05)。

8、r>　　(2)Ku70/80在正常組的陽(yáng)性表達(dá)率為79.4%(27/34),在胃癌組的陽(yáng)性率為96.6%(141/146),Ku70/80蛋白在胃癌組織中的表達(dá)水平顯著高于正常胃黏膜組織(p<0.05)。將正常組和胃癌組標(biāo)本按Hp陽(yáng)性和陰性分兩組,比較發(fā)現(xiàn)Ku70/80蛋白表達(dá)在胃癌組織的Hp陽(yáng)性表達(dá)顯著高于Hp陰性組(p<0.05)。
　　(3)采用Spearman相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn),在胃癌患者胃黏膜組織中,DNA-PKcs蛋白表達(dá)

9、水平與胃癌組織分化程度呈負(fù)相關(guān)(p<0.05),其中從高分化(G1)、中等分化(G2)到低分化(G1)表達(dá)逐漸降低,低分化(G1)和中等分化(G2)期之間表達(dá)差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.05),低分化(G1)和高分化(G3)期之間表達(dá)差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.05),而中等分化(G2)和高分化(G3)期之間表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p>0.05)。在胃癌患者胃黏膜組織中,Ku70/80蛋白表達(dá)水平與Hp感染呈負(fù)相關(guān)(p<0.05),此外,

10、Ku70/80蛋白表達(dá)水平與臨床分期呈負(fù)相關(guān)(p<0.05)。在胃癌組織中,DNA-PKcs表達(dá)水平與Ku70/80表達(dá)水平之間不具有相關(guān)性(p>0.05)。
　　2、Hp感染對(duì)GES-1和AGS細(xì)胞NHEJ信號(hào)通路相關(guān)蛋白DNA-PKcs和Ku70/80表達(dá)的影響
　　按感染復(fù)數(shù)MOI=100將Hp活菌懸液作用GES-1細(xì)胞1h后, DNA-PKcs蛋白相對(duì)表達(dá)量分別為1.16±0.08,高于對(duì)照組的1.04±0.32,差

11、異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。Hp作用GES-1細(xì)胞1、3、6、12和24 h后,Ku70/80蛋白的相對(duì)表達(dá)量分別為1.58±0.33、1.84±0.41、1.97±0.34、3.72±1.43和3.74±1.55,均高于對(duì)照組的1.24±0.32,差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);Hp作用AGS細(xì)胞1、3、6、12和24 h后,Ku70/80蛋白的相對(duì)表達(dá)量分別為4.69±0.86、3.67±0.66、2.41±0.25、1

12、.35±0.36和1.32±0.11,均比對(duì)照組的相對(duì)表達(dá)量4.84±0.77低,差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。
　　3、Hp灌胃感染蒙古沙鼠胃黏膜NHEJ信號(hào)通路相關(guān)蛋白DNA-PKcs和Ku70/80表達(dá)的變化
　　(1)Hp灌胃后第6和12個(gè)月,DNA-PKcs蛋白在感染組沙鼠胃黏膜中的陽(yáng)性率分別為96.6%(29/30)和100.0%(24/24),感染組6個(gè)月和12個(gè)月之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

13、在Hp感染第6個(gè)月和12個(gè)月,DNA-PKcs蛋白在正常對(duì)照組中均不表達(dá)(0/25),而在感染組中的總陽(yáng)性率為98.1%(53/54),兩組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。此外,灌胃感染后第6個(gè)月和12個(gè)月,實(shí)驗(yàn)組DNA-PKcs蛋白免疫組化總體得分為5.39±1.72,高于對(duì)照組的0.92±0.87,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。
　　(2)在Hp感染后第6個(gè)月和12個(gè)月,感染組的Ku70/80蛋白陽(yáng)性率分別為60.

14、0%(18/30)和79.2%(19/24),感染組6個(gè)月和12個(gè)月之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。正常對(duì)照組的Ku70/80蛋白總陽(yáng)性率為92.0%(23/25),而感染組的Ku70/80蛋白總陽(yáng)性率為68.5%(37/54),正常組和感染組之間總陽(yáng)性率差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。灌胃第6個(gè)月和12個(gè)月Ku70/80蛋白免疫組化總體得分為4.17±2.46高于對(duì)照組的總體得分6.96±2.23,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0

15、.01)。
　　研究結(jié)論:
　　1、體內(nèi)實(shí)驗(yàn)提示,DNA-PKcs和Ku70/80蛋白的高表達(dá)與胃癌關(guān)系密切。
　　2、體外實(shí)驗(yàn)表明,Hp感染主要通過(guò)調(diào)節(jié)Ku70/80的表達(dá)來(lái)影響NHEJ活動(dòng),從而參與胃黏膜細(xì)胞損傷的異常修復(fù)活動(dòng)。
　　3、本研究通過(guò)成功建立Hp感染的蒙古沙鼠模型證明,體內(nèi)感染Hp情況下, DNA-PKcs和Ku70/80表達(dá)的不一致可能導(dǎo)致了NHEJ啟動(dòng)異常的發(fā)生。
　　4、Hp感染可能