Exendin-4對不同熱缺血時間心死亡供體大鼠胰島功能影響的實驗研究.pdf

1、目的：
　　 胰島移植是治療糖尿病的理想手段,而胰島細胞分離、純化的數(shù)量及質(zhì)量成為胰島移植成功的關(guān)鍵所在。影響因素包括移植早期供胰島缺血缺氧損傷、氧化應激,胰島入血后即刻發(fā)生的血液介導的炎性反應以及免疫攻擊等。其中,缺血時間一直被認為是最重要的因素之一。眾多研究普遍認為,熱缺血時間超過30分鐘,對大鼠胰島分離純化可產(chǎn)生明顯影響,不宜用于胰島移植。本實驗研究在體外應用Exendin-4與熱缺血胰島細胞培養(yǎng),觀察Exendin-4是

2、否能夠減少熱缺血誘導胰島β細胞的凋亡,促進胰島β細胞增殖,改善胰島功能,針對胰島移植早期缺血的邊緣供體如何處理提供有效方法。
　　 材料與方法：
　　 一、材料；
　　 普通級封閉群Wistar大鼠,雌雄,體重250-280g。鼠顯微手術(shù)器械,超凈手術(shù)臺,0.22um除菌濾器,電熱恒溫水浴箱(DHW-600),多功能振蕩器,電子天平,微量加樣器,熒光倒置顯微鏡(Olympus),高速離心機(TDL-5A),CO2

3、細胞培養(yǎng)箱(Thermo)。膠原酶V型,Hank's液,Ficoll-400,丫啶橙(AO),溴乙啶(EB);RPMI-1640培養(yǎng)液,Exendin-4。
　　 二、方法：
　　 (一)大鼠熱缺血模型的建立。
　　 大鼠秤重后,腹腔注射麻醉。腹部正中切口進腹。剪開膈肌,用血管鉗夾閉心臟基底部致使心臟停搏,阻斷胸主動脈,造成心死亡供體(DCD)的熱缺血模型。
　　 (二)大鼠胰島的分離和純化。
　　

4、 采用明尼蘇達大學改良法分離、純化大鼠胰島。膠原酶V原位灌注胰腺,快速切取,水浴消化。再經(jīng)80目不銹鋼篩網(wǎng)過濾、離心。然后采用Ficoll不連續(xù)密度梯度離心純化胰島。
　　 (三)胰島培養(yǎng)及分組。
　　 根據(jù)實驗條件隨機分為三組(n=6):第一組熱缺血0分鐘組:對照組(熱缺血0分鐘胰島細胞培養(yǎng)24h);實驗組(10nmol/Lex-4與熱缺血0分鐘胰島細胞培養(yǎng)24h);第二組熱缺血30分鐘組:對照組(熱缺血30分鐘胰島

5、細胞培養(yǎng)24h);實驗組(10nmol/LEx-4與熱缺血30分鐘胰島細胞培養(yǎng)24h);第三組熱缺血45分鐘組:對照組(熱缺血45分鐘胰島細胞培養(yǎng)24h);實驗組(10nmol/LEx-4與熱缺血45分鐘胰島細胞培養(yǎng)24h)。在RPMI-1640完全培養(yǎng)基中培養(yǎng)24h。培養(yǎng)條件為:37℃,5％二氧化碳,95％空氣。
　　 三、觀察指標；
　　 應用雙硫蹤(DTZ)染色來計算分離胰島數(shù)目并判斷所提胰島的純度;丫啶橙/嗅乙啶

6、(AO/EB)熒光染色法顯示胰島細胞活率;體外葡萄糖刺激下胰島素釋放試驗。
　　 四、統(tǒng)計學分析；
　　 使用SPSS17.0統(tǒng)計軟件對實驗結(jié)果進行統(tǒng)計學分析,數(shù)據(jù)以均值±標準差(-x±s)表示,采用方差分析和t檢驗,P＜0.05為有統(tǒng)計學差異。
　　 結(jié)果：
　　 隨著熱缺血時間的延長各組獲得胰島的數(shù)量、純度、存活率及功能逐漸降低。熱缺血0分鐘、30分鐘、45分鐘組加入10nmol/LEx-4培養(yǎng)24h

7、后分離、純化的胰島數(shù)量及純度、活性均比未加入Ex-4培養(yǎng)組有所提高,熱缺血0分鐘組加入10nmol/LExendin-4的實驗組與對照組相比差異無顯著性(P＞0.05),而熱缺血30分鐘組及熱缺血45分鐘組加入10nmol/LExendin-4的實驗組與未加入10nmol/LExendin-4的對照組相比有顯著性差異(P＜0.05)。
　　 結(jié)論：
　　 1、Exendin-4對不同熱缺血時間心死亡供體大鼠胰島細胞具有保