Exendin-4對(duì)GK大鼠早期糖尿病性視網(wǎng)膜病變保護(hù)機(jī)制的研究.pdf

1、目的:觀察玻璃體腔注射Exendin-4(E4)對(duì)Ⅱ型糖尿病Goto Kakizaki(GK)大鼠血糖、體重、視網(wǎng)膜形態(tài)學(xué)、功能學(xué)的影響。探討Exendin-4參與Ⅱ型糖尿病GK大鼠早期糖尿病視網(wǎng)膜病變保護(hù)作用的相關(guān)機(jī)制。
　　方法:1.以Ⅱ型糖尿病GK大鼠為糖尿病視網(wǎng)膜病變模型，Wistar大鼠為對(duì)照，觀察GK大鼠視網(wǎng)膜功能及形態(tài)學(xué)的變化，玻璃體腔注射Exendin-4，觀察其對(duì)GK大鼠隨機(jī)血糖、空腹血糖、體重等全身代謝情況的影

2、響，以及觀察其對(duì)視網(wǎng)膜形態(tài)學(xué)的影響。ERG檢測(cè)視網(wǎng)膜功能的變化。蛋白免疫印跡(Westernimmunoblotting，WB)、免疫組織化學(xué)法（Immunohistochemistry，IHC）觀察糖尿病大鼠視網(wǎng)膜組織胰升糖素樣肽-1受體（Glucagon-like peptide-1 receptor，GLP-1R）的表達(dá)情況。2.觀察玻璃體腔注射Exendin-4對(duì)GK大鼠視網(wǎng)膜細(xì)胞計(jì)數(shù)、視網(wǎng)膜電圖(Electroretinogr

3、am，ERG)、視網(wǎng)膜細(xì)胞的膠質(zhì)化、視網(wǎng)膜細(xì)胞凋亡情況的影響，同時(shí)觀察其對(duì)線粒體凋亡通路的影響。3.觀察玻璃體腔注射Exendin-4對(duì)GK大鼠血-視網(wǎng)膜屏障關(guān)鍵蛋白o(hù)ccludin，claudin-5、炎癥因子ICAM-1、IL-1 B，血管內(nèi)皮相關(guān)因子VEGF、PIGF及血-視網(wǎng)膜屏障功能及相關(guān)信號(hào)調(diào)控通路的影響。4.高糖培養(yǎng)原代Müller細(xì)胞，觀察高糖及E4對(duì)Müller細(xì)胞GLP-1R表達(dá)及凋亡相關(guān)信號(hào)通路因子表達(dá)情況的影響。

4、
　　結(jié)果:1.8周齡-16周齡GK大鼠空腹血糖、隨機(jī)血糖較正常對(duì)照組Wistar大鼠有明顯升高，8周齡閃光ERG-Ops波振幅較Wistar大鼠有明顯降低，但b波振幅相對(duì)對(duì)照組Wistar大鼠未有明顯變化。12周齡GK大鼠閃光ERG b波振幅及Ops波振幅較Wistar大鼠明顯降低，8周齡到16周齡b波及Ops波振幅隨時(shí)間增長(zhǎng)而逐漸降低。玻璃體腔注射E40.1μ g/eye，對(duì)視網(wǎng)膜功能(ERG)的保護(hù)作用最大;相對(duì)于非治療組，

5、GK大鼠治療組隨機(jī)血糖、空腹血糖及體重?zé)o明顯特殊變化;石蠟切片免疫組化顯示，16周齡時(shí)GK大鼠GLP-1R表達(dá)降低，而GK大鼠E4治療組GLP-1R升高。2.玻璃體腔注射E4，可以減少GK大鼠視網(wǎng)膜(GCL、ONL、INL)各層細(xì)胞的丟失，其中對(duì)神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層(GCL)、外核層(ONL)的作用尤為明顯。Western blot及免疫組化顯示，相對(duì)Wistar對(duì)照組，16周齡GK大鼠視網(wǎng)膜膠質(zhì)化蛋白膠質(zhì)纖維酸性蛋白(GFAP)及波形蛋白(V

6、imentin)升高，其中GFAP尤為明顯。玻璃體腔注射E4，可以減少視網(wǎng)膜膠質(zhì)化蛋白GFAP及Vimentin的表達(dá)，尤其對(duì)GFAP的作用較大。16周齡GK大鼠視網(wǎng)膜抗凋亡蛋白Bcl-2及Bcl-xL降低，促凋亡蛋白Bax升高，凋亡執(zhí)行因子Cleaved caspase-3上調(diào)，而Bcl-2/Bax及Bcl-xL/Bax比值降低，玻璃體腔注射E4后，Bcl-2/Bax及Bcl-xL/Bax比值明顯升高，Cleaved caspase-

7、3下調(diào)。3.Western blot及視網(wǎng)膜免疫熒光顯示，相對(duì)Wistar對(duì)照組，16周齡GK大鼠血-視網(wǎng)膜屏障關(guān)鍵聯(lián)接蛋白Claudin-5和Occludin表達(dá)降低，玻璃體腔注射E4可以增加Claudin-5及Occludin表達(dá)，維持Claudin-5及Occludin的正常水平。EB灌注試驗(yàn)顯示，16周齡GK大鼠視網(wǎng)膜滲漏明顯增多，而玻璃體腔注射E4，可以減少GK大鼠視網(wǎng)膜的滲漏。5.玻璃體腔注射E4可下調(diào)GK大鼠視網(wǎng)膜ERK1

8、/2、AKT(Ser473)及STAT3的磷酸化。6.原代培養(yǎng)Wistar大鼠Müller細(xì)胞，細(xì)胞爬片免疫熒光顯示，GLP-1R在Müller細(xì)胞膜上大量表達(dá)。高糖20mmol/L培養(yǎng)72h情況下，Müller細(xì)胞GLP-1R表達(dá)明顯減低，添加E4培養(yǎng)，GLP-1R表達(dá)升高，在48h時(shí)，GLP-1R表達(dá)達(dá)到高峰。高糖20mmol/L培養(yǎng)72h情況下，Bcl-2表達(dá)降低，添加E4培養(yǎng)后，Bcl-2表達(dá)升高，在72h后達(dá)到高峰。
　

9、　結(jié)論:1.Ⅱ型糖尿病GK大鼠視網(wǎng)膜功能的演變符合早期DR的特征，可作為早期糖尿病性視網(wǎng)膜病變模型。2.玻璃體腔注射E4對(duì)GK大鼠體重、空腹血糖、隨機(jī)血糖等全身代謝指標(biāo)無明顯影響。玻璃體腔注射E4可以保護(hù)GK大鼠視網(wǎng)膜功能及預(yù)防視網(wǎng)膜細(xì)胞的丟失。GLP-1R在視網(wǎng)膜神經(jīng)感覺層各層細(xì)胞上廣泛表達(dá)。3.E4保護(hù)Ⅱ型糖尿病早期視網(wǎng)膜病變是通過減輕視網(wǎng)膜的膠質(zhì)化、經(jīng)線粒體途徑的抗凋亡和維持血-視網(wǎng)膜屏障功能來實(shí)現(xiàn)的。4.PIGF可能是E4干預(yù)保