乙型腦炎病毒—偽狂犬病病毒二聯基因工程疫苗研究.pdf

1、乙型腦炎病毒和偽狂犬病病毒都是引起母豬繁殖障礙的重要病原之一，給養(yǎng)豬業(yè)造成巨大的經濟損失。而且乙型腦炎是一種人畜共患病，豬是乙腦病毒的主要放大宿主，因此對豬乙腦病毒的控制具有十分重要的公共衛(wèi)生意義。兩種病原都是病毒，預防控制的主要措施除了常規(guī)的生物安全外，就是疫苗預防接種。目前尚無家畜專用的JEV疫苗株，主要用人類疫苗使用的弱毒株和強毒株。同時由于現代化養(yǎng)殖中豬群頻繁接種，對豬群造成很大的應激，嚴重影響生產性能。目前，國際上動物用疫苗的

2、發(fā)展趨勢是標記疫苗及其配套的監(jiān)測方法。鑒于此，本研究從乙腦病毒CQRC-1株擴增了主要免疫原性基因E、PrM，構建了兩株表達乙腦病毒主要免疫原性基因的重組偽狂犬病病毒，即SA215(E)和SA215(F)，并對兩株重組病毒進行生物學特性研究。同時重組疫苗接種后需要一種特異的血清學鑒別方法，鑒于此對乙腦病毒非結構蛋白基因NS1進行原核表達，并建立了ELSIA方法。其主要的研究內容如下： 1.乙腦病毒PrM、E、NS1和NS3基因的

3、克隆和測序 根據已報道的乙腦病毒CQRC-1株的核苷酸序列設計四對引物，在上下游引物的5’端引入一酶切位點。采用RT-PCR方法，擴增了PrM、E、NS1和NS3基因，分別利用TA克隆插入pMD18-Tsimple載體，命名為PrM-T、E-T、NS1-T和NS3-T。測序結果表明E基因與已公布的SA14、JaGAr01和P3株核苷酸同源性分別為97、97、96％；PrM同源性分別為97、97、96％；NS1同源性高達99、98

4、、98％；NS3核苷酸同源性分別為99、98、98％；與報道的CQRC-1的對應序列相同。 2.表達JEVE和PrM基因的重組偽狂犬病病毒的構建 從E-T和PrM-T酶切獲得JEV的E基因和PrM基因，分別插入到PRVgI基因缺失通用轉移載體pPI-2.EGFP的多克隆位點中，構建轉移質粒，命名為PPE和PPM。然后將質粒PPE和PPM分別與PRV基因缺失株SA215基因組共轉染Vero細胞，通過同源重組，構建了融合表達

5、JEVE基因和.JEVPrM基因的重組偽狂犬病毒株，命名為SA215(E)和SA215(F)。經熒光檢測、PCR、Southern轉印雜交鑒定，結果表明SA215(E)和SA215(F)構建成功；Western免疫印跡檢測表明JEVE基因和JEVPrM基因在重組病毒內獲得表達，SA215(E)產生大小約90kD的融合蛋白；而SA215(F)產生大小約60kD融合蛋白，并且，表明產生的融合蛋白具有反應原性。 3.重組病毒SA215

6、(E)、(F)部分生物學特性及穩(wěn)定性 SA215(E)、(F)和SA215對Vero細胞的致病變效應、噬斑形態(tài)、一步法生長曲線試驗以及電子顯微鏡觀察病毒粒子形態(tài)特征。結果表明SA215在插入了JEVE或PrM基因后，并不改變其生物學特性。SA215(E)、(F)連續(xù)傳6帶，在熒光顯微鏡下可見熒光，用PCR跟蹤檢測仍可擴增出JEVE基因或PrM基因，表明SA215(E)、(F)至少在6代內穩(wěn)定。 4.PRY-JEV二聯基因

7、工程疫苗對仔豬、小鼠和家兔的免疫原性和安全性試驗 將重組偽狂犬病毒SA215(E)和(F)制成PRV-JEV二聯基因工程疫苗接種小鼠、家兔和仔豬。并對該疫苗的免疫原性和安全性進行評價。重組偽狂犬病毒SA215(E)、SA215(F)、SA215和野毒Fa株分別以105TCID50劑量接種小鼠，結果接種Fa株小鼠全部死亡，而接種SA215(E)、(F)和SA215株的小鼠全部存活；將四株分別以107TCID50接種家兔，接種Fa的

8、家兔在14天全都死亡，而接種SA215(E)、(F)和SA215株的家兔全部存活；初生仔豬接種SA215(E)和SA215(F)后除前三天體溫升高外，其他正常。這些結果表明SA215(E)和(F)株的毒力顯著低于PRV野毒株，而與親本株SA215相近，初步驗證了重組病毒的安全性。 將PRV-JEV二聯基因工程疫苗SA215(E)、(F)及SA215分別加強免疫小鼠后，腹膜內攻毒JEV強毒株CQRC-1，結果顯示SA215(E)能

9、100％(8/8)的保護，SA215(F)僅50％(4/8)保護，而SA215完全不能保護小鼠JEV攻毒(0/8);血清中和試驗表明SA215(E)接種兩次后即首免后28天中和抗體滴度達1:20，而SA215(F)僅為1:4。SA215(E)、SA215(F)和SA215以107TCID50接種家兔兩次后，用107TCID50PRVFa株攻毒，SA215(E)、(F)和SA215都能100％(4/4)保護PRV強毒攻毒。淋巴細胞增殖試驗

10、(MTT法)結果顯示SA215(E)和(F)能誘導小鼠特異脾淋巴細胞的增殖;而T細胞亞類數量的檢測結果顯示SA215(E)和SA215(F)免疫小鼠能有效提高T細胞數量，增強小鼠的免疫水平。這些結果表明重組偽狂犬病毒SA215(E)和SA215(F)制成的PRY-JEV二聯基因工程疫苗能成功誘導小鼠產生細胞免疫和體液免疫應答。以上結果表明重組病毒SA215(E)可以作為預防豬乙腦和偽狂犬病的二聯基因工程標記疫苗候選株。 5.對已

11、構建好的重組質粒NS1-T和NS3-T通過雙酶切后，得到JEVNS1和NS3基因，將其亞克隆入原核表達載體pET-32a(+)中，在IPTG的誘導下，NS1和NS3基因以融合蛋白的形式進行表達。通過表達條件的優(yōu)化，確立了NS1蛋白表達時的最佳誘導物濃度為0.4mmol/L，誘導時間為4h，誘導溫度為37℃。以純化的融合蛋白為抗原包被酶標板，優(yōu)化抗原最佳包被濃度為10μg/ml，血清稀釋度1:40，最適封閉液為1％BSA，血清反應時間為9