黃芩素對TGF-β1體外誘導(dǎo)肺成纖維細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞分化的影響.pdf

1、目的:研究黃芩素(Baicalein,BAE)對TGF-β1體外誘導(dǎo)肺成纖維細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞分化的影響，并初步探討其作用機(jī)制。
　　方法:體外培養(yǎng)人胚肺二倍體成纖維細(xì)胞WI-38，制備TGF-β1誘導(dǎo)肺成纖維細(xì)胞WI-38向肌成纖維細(xì)胞分化的細(xì)胞模型。采用MTT法檢測WI-38細(xì)胞的增殖率，Western Blot法檢測細(xì)胞內(nèi)α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)、I型膠原蛋(Collage

2、nI,ColI)及相關(guān)蛋白表達(dá)的變化，光學(xué)顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)，免疫組化檢測細(xì)胞內(nèi)α-SMA蛋白表達(dá)。隨后在TGF-β1體外誘導(dǎo)肺成纖維細(xì)胞WI-38向肌成纖維細(xì)胞分化的細(xì)胞模型上，給予不同劑量的BAE干預(yù)，用MTT法檢測BAE對WI-38細(xì)胞的增殖的影響，免疫組化法觀察WI-38細(xì)胞內(nèi)α-SMA、Smad2蛋白的表達(dá)，透射電鏡觀察WI-38細(xì)胞中細(xì)胞器的結(jié)構(gòu)改變，掃描電鏡觀察WI-38細(xì)胞表面結(jié)構(gòu)改變。Westorn Blot檢測WI-

3、38細(xì)胞分化過程中相關(guān)蛋白α-SMA、ColI、Smad2、p-Smad2、Smad3、p-Smad3、Smad7蛋白的表達(dá)，以Reverse Transcription PCR法檢測BAE對TGF-β1體外誘導(dǎo)肺成纖維細(xì)胞WI-38細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞分化過程中α-SMA、ColI、Smad2、Smad3、Smad7 mRNA表達(dá)的影響。
　　結(jié)果：MTT法檢測表明：與正常WI-38細(xì)胞組相比，5~40μg·L-1 TGF-β1作

4、用WI-38細(xì)胞4d后，細(xì)胞增殖率上升(P<0.05,P<0.01)，呈劑量依賴性；光學(xué)顯微鏡下可見：細(xì)胞增殖顯著，細(xì)胞形態(tài)改變，從較大的紡錘形或星形結(jié)構(gòu)的成纖維細(xì)胞分化為扁平狀纖維結(jié)構(gòu)的肌成纖維細(xì)胞，分化明顯；免疫組化熒光檢測顯示：正常WI-38細(xì)胞組α-SMA蛋白僅在細(xì)胞核內(nèi)表達(dá)，模型組α-SMA蛋白在細(xì)胞核與胞漿內(nèi)均表達(dá)；Western Blot結(jié)果：TGF-β1體外誘導(dǎo)4d后，WI-38細(xì)胞內(nèi)α-SMA、ColI蛋白的表達(dá)均上調(diào)

5、，這一結(jié)果與免疫組化結(jié)果一致；與TGF/Smads信號通路相關(guān)的Smad2、Smad3蛋白表達(dá)均上調(diào)，并使其磷酸化(P<0.01,P<0.05)。由此表明在本實(shí)驗(yàn)條件下，TGF-β1體外誘導(dǎo)WI-38成纖維細(xì)胞能分化為肌成纖維細(xì)胞的細(xì)胞模型，該作用可以維持3d。BAE干預(yù)下，光學(xué)顯微鏡觀察結(jié)果：TGF-β1誘導(dǎo)WI-38細(xì)胞分化過程中細(xì)胞增殖作用被明顯抑制；免疫組化顯示：α-SMA蛋白在WI-38細(xì)胞包漿內(nèi)表達(dá)減少，Smad2蛋白在WI

6、-38細(xì)胞核內(nèi)表達(dá)減少；透射電鏡觀察表明：WI-38細(xì)胞線粒體腫脹減少，髓鞘樣變改善；掃描電鏡觀察顯示：WI-38細(xì)胞表面微絨毛減少，褶皺較少出現(xiàn)；Western Blot結(jié)果：WI-38細(xì)胞中α-SMA、ColI蛋白的表達(dá)下調(diào)(P<0.01,P<0.05)，同時(shí)與TGF-β/Smads信號通路相關(guān)的Smad2、p-Smad2、Smad3、p-Smad3蛋白的表達(dá)下調(diào)(P<0.01,P<0.05)，而Smad7蛋白表達(dá)上調(diào)(P<0.05

7、)；RT-PCR結(jié)果：TGF-β1體外誘導(dǎo)WI-38細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞分化α-SMA、ColI、Smad2、Smad3 mRNA的表達(dá)下調(diào)(P<0.01,P<0.05)，Smad7 mRNA的表達(dá)上調(diào)(P<0.05)，由此提示BAE可抑制WI-38細(xì)胞分化。
　　結(jié)論：BAE對TGF-β1體外誘導(dǎo)肺成纖維細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞的在分化過程有一定的抑制作用，該作用與抑制Smad2/3磷酸化及其細(xì)胞核轉(zhuǎn)位，上調(diào)Smad7，從而下調(diào)α-SM