FUT8-siRNA可減輕TGF-β1對(duì)體外培養(yǎng)的腎小管上皮細(xì)胞—肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)分化的影響.pdf

1、目的：研究α-1，6巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶（α-1，6 fucosyltransferase，F(xiàn)UT8）在TGF-β1誘導(dǎo)的人近端腎小管上皮細(xì)胞（Human kidney-2，HK-2）-肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)分化（epithelial to mesenchymal transition，EMT）中的作用。 方法：將體外培養(yǎng)的HK-2細(xì)胞隨機(jī)分為三組：①（CON組）對(duì)照組常規(guī)培養(yǎng)；②（TGF組）：加入濃分別為（5、10、20、40）ng/ml的

2、TGF-β1刺激細(xì)胞；③（TGFF組）：使用siRNA干擾技術(shù)沉默細(xì)胞的FUT8基因，隨后再加入20ng/mlTGF-β刺激細(xì)胞。前期工作中，我們合成了熒光素標(biāo)記的FUT8-siRNA并瞬時(shí)轉(zhuǎn)染HK-2細(xì)胞，使用倒置熒光顯微鏡檢測(cè)siRNA的轉(zhuǎn)染效率；PT-PCR及FUT8免疫熒光技術(shù)分別檢測(cè)FUT8-siRNA基因沉默效果及蛋白抑制率。刺激細(xì)胞72小時(shí)后，觀察各組細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變；分別使用westernblot及免疫熒光技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞總F

3、UT8蛋白及其底物α-1，6巖藻糖鏈的表達(dá)情況；此外使用免疫沉淀（Immunoprecipitation，IP）結(jié)合凝集素印跡檢測(cè)特異性結(jié)合在TGF-βⅠ/Ⅱ型受體ALK-5（type Ⅰreceptoractivin-likekinase5）及TGF-βRⅡ（TGF-βtypeⅡreceptor）上的巖藻糖鏈的表達(dá)；使用免疫熒光技術(shù)共染FUT8、ALK5進(jìn)一步驗(yàn)證兩者的定位及表達(dá)；隨后，使用westernblot及免疫組化染色技術(shù)對(duì)P

4、-smad2/3進(jìn)行評(píng)估；而α-平滑肌肌動(dòng)蛋白（alpha-smoothmuscleactin，α-SMA）也使用免疫組化染色進(jìn)行評(píng)估。 結(jié)果：RT-PCR及westernblot檢測(cè)結(jié)果顯示FUT8-siRNA在100nM濃度下成功干擾HK-2細(xì)胞中FUT8基因及蛋白水平的表達(dá)，且轉(zhuǎn)染效率達(dá)90%。使用相差顯微鏡觀察CON組細(xì)胞呈正常地上皮細(xì)胞鋪路石樣形態(tài)；TGF組細(xì)胞發(fā)生明顯的形態(tài)學(xué)改變，可見細(xì)胞肥大、拉長(zhǎng)，提示發(fā)生成纖維化

5、改變；而TGFF組可以一定程度的抑制TGF-β1誘導(dǎo)的HK-2細(xì)胞形態(tài)的改變。與CON組相比，TGF組FUT8總蛋白表達(dá)升高（P<0.05），而其底物巖藻糖鏈并無顯著的變化（P>0.05）；TGFF組與TGF組相比，F(xiàn)UT8蛋白（P<0.01）及其底物巖藻糖鏈（P<0.05）表達(dá)都降低。IP結(jié)合凝集素印跡顯示特異性結(jié)合在TGF-βRⅡ的巖藻糖鏈的表達(dá)情況，TGF組與CON組相比表達(dá)上調(diào)（P<0.05），而TGFF組與TGF組相比明顯下調(diào)

6、（P<0.01）；以上變化趨勢(shì)與ALK5結(jié)合的巖藻糖鏈的變化相同；并且使用熒光共聚焦顯微鏡進(jìn)一步證實(shí)了ALK5與FUT8兩者共表達(dá)，并且表達(dá)位點(diǎn)完全重合。TGF組呈劑量依賴性上調(diào)P-smad2/3表達(dá)（P<0.05）；而TGFF組與TGF組比較，F(xiàn)UT8-siRNA可以阻斷其上調(diào)（P<0.05）；同樣，α-SMA免疫組化結(jié)果顯示TGF-β1可劑量依賴性上調(diào)其表達(dá)（P<0.05），而可以被FUT8-siRNA所阻斷（P<0.05）。