利多卡因治療特應(yīng)性皮炎的機(jī)制研究.pdf

1、背景:特應(yīng)性皮炎(atopicdermatitis，AD)是一種炎癥性的、慢性復(fù)發(fā)性、瘙癢性皮膚病。AD患者皮損處常出現(xiàn)金黃色葡萄球菌定植，其中定植于AD患者皮損表面30-60％金葡菌菌株可以釋放金黃色葡萄球菌外毒素超抗原(StaphylococcalenterotoxinA，SEA和StaphylococcalenterotoxinB，SEB)。金黃色葡萄球菌外毒素對(duì)外周血來(lái)源的單個(gè)核細(xì)胞(peripheralbloodmononuc

2、learcell，PBMCs)尤其是其中的T細(xì)胞的激活在AD的發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮了關(guān)鍵作用，前期有研究發(fā)現(xiàn)，利多卡因可以明顯減弱外來(lái)變應(yīng)原誘導(dǎo)的哮喘患者PBMCs的增值和部分細(xì)胞因子的釋放;另外，跟皮膚屏障功能相關(guān)的中間絲相關(guān)蛋白（filaggrin，F(xiàn)LG）和抗菌肽(humanbeta-defesins，HBDs)在AD患者皮內(nèi)表達(dá)嚴(yán)重缺失。目前，臨床上常用的類(lèi)固醇類(lèi)藥物治療AD由于其給皮膚屏障功能帶來(lái)的副作用，正被受到質(zhì)疑，我科在臨床上

3、使用的利多卡因靜脈封閉治療AD，具有療效可靠、價(jià)格低廉、停用沒(méi)有明確的“反跳”現(xiàn)象等優(yōu)點(diǎn)，但因作用機(jī)制尚不清，限制了它的廣泛使用，因此對(duì)其治療AD的機(jī)制進(jìn)行探索，將有助于更加準(zhǔn)確地使用這一悠久而又低廉的治療方法，為廣大患者服務(wù)。
　　目的:通過(guò)研究利多卡因?qū)EA或SEB刺激激活的AD患者PBMCs的影響，SEA和SEB是否可以直接抑制FLG和HBDs的表達(dá)，利多卡因?qū)EA、SEB和TH2型的細(xì)胞因子調(diào)控的FLG和HBDs表達(dá)的

4、影響和相關(guān)機(jī)制，以及利多卡因靜脈封閉治療對(duì)AD患者皮損處FLG表達(dá)的影響，探索利多卡因治療AD的相關(guān)機(jī)制。
　　方法:抽取10例AD患者外周血，常規(guī)分離培養(yǎng)PBMCs，分別以SEA或SEB刺激共孵育，同時(shí)加入不同濃度的利多卡因，隨后采用3H-TdR摻入法檢測(cè)PBMCs的增值，酶聯(lián)免疫吸附劑測(cè)定(EnzymeLinkedImmunoSorbentAssay，ELISA)檢測(cè)部分TH1和TH2型細(xì)胞因子的釋放，檢測(cè)利多卡因是否可以抑制

5、SEA或SEB對(duì)AD患者PBMCs的激活;實(shí)時(shí)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RealtimePCR，RT-PCR)和蛋白質(zhì)印跡分析(WesternBlotanalysis，WB)分別檢測(cè)利多卡因?qū)εcSEA和SEB激活的AD患者PBMCs共孵育的人角質(zhì)形成細(xì)胞株HaCaT細(xì)胞內(nèi)FLGmRNA和蛋白表達(dá)的影響，以此驗(yàn)證利多卡因是否可以抑制金葡菌超抗原SEA和SEB對(duì)AD患者PBMCs的激活。
　　以不同濃度的SEA或SEB刺激HaCaT細(xì)胞或原代人

6、表皮角質(zhì)形成細(xì)胞(Normalhumankeratinocytes，NHK)，通過(guò)改變培養(yǎng)環(huán)境中Ca2+濃度調(diào)節(jié)其分化，分別采用RT-PCR、Westernblot、ELISA或者免疫熒光染色技術(shù)（immunofluorescencestaining）檢測(cè)SEA或SEB對(duì)分化的角質(zhì)形成細(xì)胞(keratinocytes，KCs)內(nèi)FLG和HBDs的表達(dá)的影響，經(jīng)SEA或SEB刺激后，KCs內(nèi)細(xì)胞因子的釋放采用ELISA方法檢測(cè)，分化前后K

7、Cs細(xì)胞表面HLA-DR的表達(dá)通過(guò)流式細(xì)胞儀檢測(cè)。同時(shí)檢測(cè)利多卡因?qū)EA、SEB以及TH2型細(xì)胞因子刺激的KCs細(xì)胞內(nèi)FLG和HBDs的表達(dá)是否有影響，并初步探討利多卡因阻斷金葡菌超抗原和TH2型細(xì)胞因子對(duì)KCs影響的機(jī)制。切取6例接受靜脈封閉注射利多卡因治療的患者治療前后同一皮損處皮膚樣本，免疫熒光染色觀察FLG表達(dá)的變化。
　　結(jié)果:利多卡因以劑量依賴(lài)的方式顯著抑制了SEA或SEB刺激的AD患者PBMCs的增值和IL-4、I

8、L-5、IL-13、TNF-α以及IFN-γ的釋放，同時(shí)明顯阻斷了與SEA和SEB激活的AD患者PBMCs共孵育的HaCaT細(xì)胞內(nèi)FLG表達(dá)的下調(diào)。
　　SEA和SEB顯著下調(diào)了鈣離子誘導(dǎo)的、分化狀態(tài)的HaCaT細(xì)胞內(nèi)FLG、HBD-1以及HBD-3mRNA和蛋白的表達(dá)，并在NHK細(xì)胞內(nèi)得到了驗(yàn)證，SEA、SEB和TH2型的細(xì)胞因子一起更加顯著的下調(diào)了分化狀態(tài)的HaCaT細(xì)胞FLG和HBD-3的表達(dá);SEA和SEB顯著上調(diào)了KCs

9、細(xì)胞內(nèi)TNF-α、IL-4和IL-13表達(dá)，KCs細(xì)胞分化后其表面MHCⅡ類(lèi)分子(majorhistocompatibilitycomplexclassⅡmolecules，MHCⅡ)的表達(dá)輕微上調(diào);上述炎癥因子（TNF-α、IL-4和IL-13）的阻斷抗體未能顯著阻斷SEA、SEB下調(diào)KCs內(nèi)FLG和HBDs的表達(dá)，MHCⅡ類(lèi)分子阻斷抗體(anti-humanHLA-DRantibody，L243)顯著抑制了SEA、SEB對(duì)分化狀態(tài)的

10、KCs內(nèi)FLG和HBDs表達(dá)的下調(diào)，在經(jīng)IFN-γ刺激的高表達(dá)MHCⅡ類(lèi)分子的KCs內(nèi)，SEA、SEB極顯著的下調(diào)了FLG和HBDs的表達(dá)，L243可顯著抑制SEA、SEB對(duì)高表達(dá)MHCⅡ類(lèi)分子的KCs內(nèi)FLG和HBDs表達(dá)的下調(diào)，L243對(duì)TH2型的細(xì)胞因子下調(diào)分化狀態(tài)的KCs內(nèi)FLG和HBD-3的表達(dá)無(wú)顯著影響，金葡菌超抗原SEA和SEB下調(diào)KCs內(nèi)FLG和HBDs的表達(dá)需要MHCⅡ類(lèi)分子的嚴(yán)格參與，而TH2型細(xì)胞因子無(wú)需MHCⅡ類(lèi)

11、分子的的介導(dǎo)下調(diào)KCs內(nèi)FLG和HBD-3的表達(dá);在SEA和SEB刺激的KCs細(xì)胞內(nèi)，與對(duì)照組相比，利多卡因顯著抑制了KCs細(xì)胞內(nèi)TNF-α、IL-4和IL-13的釋放;利多卡因顯著抑制了IFN-γ刺激的或鈣離子誘導(dǎo)的分化狀態(tài)的KCs細(xì)胞表面MHCⅡ類(lèi)分子的上調(diào);利多卡因顯著阻斷了金葡菌超抗原SEA、SEB對(duì)FLG、HBD-1以及HBD-3mRNA和蛋白表達(dá)的下調(diào);AD患者接受靜脈封閉注射利多卡因治療后，其皮損處FLG的表達(dá)明顯上調(diào)。<

12、br>　　結(jié)論:利多卡因?qū)EA和SEB刺激的AD患者PBMCs的激活具有明顯的抑制作用，這一發(fā)現(xiàn)可能是利多卡因通過(guò)發(fā)揮抗炎作用有效治療AD的機(jī)制之一。SEA和SEB對(duì)分化過(guò)程中的KCs細(xì)胞FLG和HBDs表達(dá)起著負(fù)調(diào)節(jié)的作用，利多卡因通過(guò)抑制KCs細(xì)胞表面MHCⅡ類(lèi)分子的表達(dá)和TNF-α、IL-4和IL-13的釋放顯著阻斷了金葡菌超抗原對(duì)KCs細(xì)胞FLG、HBD-1以及HBD-3表達(dá)的下調(diào);同時(shí)利多卡因也顯著阻斷了TH2型的細(xì)胞因子對(duì)

13、KCs細(xì)胞內(nèi)FLG和HBD-3的下調(diào);利多卡因通過(guò)間接、直接兩種方式阻斷了外來(lái)變應(yīng)原對(duì)AD患者皮膚屏障功能的破壞，有助于修復(fù)皮膚屏障功能。以上研究結(jié)果，為利多卡因有效的治療AD提供了一定的理論依據(jù)。我們的研究結(jié)果還表明，金葡菌除了可以直接激活A(yù)D患者PBMCs，釋放大量的炎癥因子，下調(diào)AD患者FLG和HBDs的表達(dá)以外，金葡菌超抗原本身也是造成AD中間絲相關(guān)蛋白表達(dá)下調(diào)的重要因素，并且能抑制表皮抗感染功能。這一發(fā)現(xiàn)可以部分解釋AD患者經(jīng)