5-羥色胺1A受體在顳葉癲癇中的作用及機制研究.pdf

1、背景:
　　癲癇是一種常見的神經系統(tǒng)疾病，其特點是神經元的異常興奮和同步化放電。癲癇持續(xù)狀態(tài)（Status epilepticus，SE）時死亡率高達20％。慢性癲癇長期反復發(fā)作也可引起不可逆的神經功能損害，導致遺留嚴重的認知功能損害和行為改變。雖然臨床已有多種抗癲癇藥物，但對于難治性癲癇的療效仍然有限，需要進一步尋找新的治療靶點。
　　5-羥色胺(Serotonin，5-HT)是一種腦內重要的神經遞質，與抑制癲癇活動密切相

2、關。5-HT受體在腦內共有超過14種亞型，其中5-HT1A受體與癲癇關系最為密切[2-4]。目前5-HT1A受體在急性和慢性癲癇動物模型中究竟是抑制還是促進癲癇作用仍存在一定的爭議。這種截然相反的作用可能和各個癲癇模型的機制不同相關。pilocarpine模型相比KA模型更能全面模擬SE過程中的各種特性和長時間SE發(fā)作所帶來的嚴重損害。而杏仁核慢性電點燃模型能較好模擬慢性顳葉癲癇發(fā)生過程，因此采用該兩種模型來研究5-HT1A受體在急性和

3、慢性癲癇過程中的作用，能提供更好的科學價值。
　　5-HT1A受體在腦內分布廣泛，主要分布在腦干、額葉皮層、邊緣系統(tǒng)等區(qū)域。目前尚不清楚究竟是哪些部位的5-HT1A受體參與了對SE和癲癇形成的作用。有報道海馬富含5-HT1A受體且在癲癇發(fā)生發(fā)展過程中非常重要。5-HT1A受體在顳葉癲癇患者和慢性動物模型中致癇灶、邊緣系統(tǒng)區(qū)域密度下降[4,6]，可能參與了癲癇的發(fā)生和發(fā)作機制。研究各部位5-HT1A受體在癲癇過程中的動態(tài)變化可能有助

4、于明確5-HT1A受體的作用機制。但目前尚無在SE模型和慢性杏仁核模型中干預的研究，因此本研究擬通過皮下和海馬局部干預，明確5-HT1A受體對Li-pilocarpine所致SE和杏仁核慢性點燃模型癲癇的作用，觀察海馬5-HT1A受體是否參與其中，為癲癇的治療尋求新的靶點。
　　目前對5-HT1A受體表達變化的研究多為針對慢性癲癇形成的過程，而對急性SE過程中5-HT1A受體的變化未見有報道。細胞外調節(jié)激酶(Extracellua

5、rsignal-regulated kinase，ERK)參與MAPK信號轉導通路[7]。已知5-HT1A受體激活在正常大鼠中能抑制ERK激活。而ERK通路在SE過程中激活后，能與下游的電壓依賴性鉀離子通道蛋白Kv4.2結合，抑制Kv4.2在CA1區(qū)神經元突觸體和細胞膜上表達及超極化電流的形成，表現(xiàn)為促進癲癇形成的作用[8-12]。因此，本研究擬觀察海馬和腦干5-HT1A受體在Li-pilocarpine模型SE過程中的表達變化及Li-

6、pilocarpine模型中激活5-HT1A受體后對ERK通路活化的作用，分析5-HT1A受體的相關作用機制。
　　第一部分5-HT1A受體對大鼠癲癇持續(xù)狀態(tài)的作用目的:
　　通過皮下和海馬局部注射5-HT1A受體激動劑或拮抗劑，觀察5-HT1A受體對Li-pilocarpine大鼠癲癇持續(xù)狀態(tài)發(fā)作的作用。
　　方法:
　　1.280-300 g SD大鼠手術植入顱骨電極，術后休息7-10天，按照體重配對分為7個

7、實驗組，分別在pilocarpine注射前1小時給予皮下注射以下試劑:組1:磷酸鹽緩沖液(PBS)1 mL/kg;組2:激動劑8-OH-DPAT0.01mg/kg;組3:8-OH-DPAT0.1 mg/kg;組4:8-OH-DPAT0.5 mg/kg;組5:8-OH-DPAT1.0mg/kg;組6:拮抗劑WAY-1006351.0mg/kg，組7:激動劑8-OH-DPAT0.01mg/kg注射后即刻給予拮抗劑WAY-1006351.0m

8、g/kg。
　　2.大鼠給予LiCl3meq/kg，22-24h后給予腹腔注射pilocarpine。記錄行為學發(fā)作GS潛伏期、GS持續(xù)時間，腦電圖上首次癇樣放電、SE潛伏期及總放電時間。腦電記錄從pilocarpine注射前半小時到后2小時為止。
　　3.雙側海馬干預大鼠給予手術植入顱骨電和微量注射導管(AP:-3.5 mm，L:±2.5 mm，V:-2.9mm)。術后休息7-10天。體重配對分為8-OH-DPAT組和PB

9、S組，在pilocarpine注射前15min分別給予8-OH-DPAT1μg(1μL)和PBS1μL。其余Li-pilocarpine模型建立和腦電、行為學觀察同前。
　　結果:
　　1.腹腔給予激動劑各組癲癇持續(xù)狀態(tài)的發(fā)生率和急性死亡率未發(fā)現(xiàn)存在顯著性差異。
　　2.行為學觀察激動劑8-OH-DPAT0.5 mg/kg和1.0 mg/kg組的GS發(fā)作潛伏期顯著增高，而GS發(fā)作累計持續(xù)時間較PBS組顯著降低，且1.0

10、 mg/kg組作用效果優(yōu)于0.5 mg/kg組。
　　3.激動劑8-OH-DPAT0.5 mg/kg和1.0 mg/kg組的首次癇樣放電和SE起始潛伏期顯著增高，總放電時間較PBS組顯著降低，且1.0 mg/kg組作用效果優(yōu)于0.5 mg/kg組。
　　4.低劑量（0.01 mg/kg和0.1 mg/kg）8-OH-DPAT對行為學和腦電發(fā)作均無抑制作用。
　　5.激動劑8-OH-DPAT1.0 mg/kg組的抑制作用

11、能被拮抗劑WAY-100635有效抑制，但單純注射拮抗劑對發(fā)作無影響。
　　6.海馬干預中，8-OH-DPAT組GS持續(xù)時間較PBS組下降，但對GS和腦電圖上放電潛伏期無作用。
　　結論:
　　1.5-HT1A受體激活對Li-pilocarpine模型癲癇持續(xù)狀態(tài)形成和發(fā)作有抑制作用。
　　2.皮下注射低劑量激動劑0.01和0.1 mg/kg對Li-pilocarpine模型癲癇發(fā)作無影響。
　　3.雙側海

12、馬內5-HT1A受體激活能抑制Li-pilocarpine模型癲癇持續(xù)狀態(tài)發(fā)作的嚴重程度，但不影響癲癇持續(xù)狀態(tài)形成過程。
　　第二部分5-HT1A受體對杏仁核點燃癲癇形成的作用目的:
　　通過腹腔和海馬局部給予5-HT1A受體激動劑或拮抗劑，觀察5-HT1A受體對杏仁核點燃過程癲癇形成的作用。
　　方法:
　　1.280-300g SD大鼠給予手術植入基底旁杏仁核電極，術后休息7-10天。大鼠測定初始后放電閾值（

13、ADT）后，每天給予大鼠1次電流刺激，刺激強度為ADT，共刺激16天。記錄大鼠發(fā)作等級、后放電時程（ADD）等參數(shù)。
　　2.皮下給藥大鼠按體重配對分為6個實驗組，分別在每天電刺激前1小時皮下注射以下試劑:組1:磷酸鹽緩沖液(PBS)1mL/kg;組2:激動劑8-OH-DPAT0.01mg/kg;組3:8-OH-DPAT0.1 mg/kg;組4:8-OH-DPAT0.5 mg/kg;組5:8-OH-DPAT1.0 mg/kg;組6

14、:激動劑8-OH-DPAT0.01mg/kg注射后即刻給予拮抗劑WAY-1006351.0mg/kg。
　　3.海馬局部干預大鼠在手術時右側海馬植入微量注射導管(AP:-3.5 mm，L:-2.5 mm，V:-2.9mm)，分為8-OH-DPAT組和PBS組，在每天點燃前15min分別給予8-OH-DPAT1μg(1μL)和PBS1μL。其余同前。
　　結果:
　　1.皮下注射激動劑8-OH-DPAT1.0 mg/kg

15、和0.5 mg/kg組顯著延緩杏仁核點燃過程發(fā)作等級的增加，1.0 mg/kg組同時縮短每天點燃的ADD，而且這種作用能被同時注射拮抗劑WAY-1006351.0 mg/kg抑制。
　　2.激動劑8-OH-DPAT1.0 mg/kg組停留在1級的天數(shù)長于PBS組，停留在5級的天數(shù)短于PBS組。同時，達到2、3、4、5級所需要的刺激數(shù)均多于PBS組。0.5 mg/kg組存在類似作用趨勢，但統(tǒng)計無顯著性差異。激動劑1.0 mg/kg組

16、比PBS組在部分性階段（1-3級）停留更長的時間，而在全面性階段（4-5級）停留時間更短，且該作用能被拮抗劑有效抑制。
　　3.激動劑加拮抗劑組停留在4級的天數(shù)長于激動劑1.0 mg/kg組，而到達2、3、4、5級的天數(shù)明顯短于激動劑1.0 mg/kg組，其中到達3級和4級的天數(shù)兩組間存在顯著性差異。
　　4.低劑量激動劑0.1和0.01 mg/kg組對發(fā)作等級和ADD各指標均無影響。
　　5.海馬局部干預與PBS組相

17、比對點燃過程發(fā)作等級和ADD各指標均無影響。
　　結論
　　1.皮下注射5-HT1A受體激動劑8-OH-DPAT1.0 mg/kg延緩杏仁核模型點燃進程，對慢性顳葉癲癇形成具有抑制作用，且這種作用在部分性癲癇階段最明顯。
　　2.皮下注射低劑量激動劑0.01和0.1 mg/kg對杏仁核模型癲癇形成無影響。
　　3.海馬5-HT1A受體不參與對慢性癲癇形成的抑制作用。
　　第三部分癲癇持續(xù)狀態(tài)中5-HT1A受

18、體表達水平的動態(tài)變化及ERK通路的研究目的:
　　明確腦干和海馬5-HT1A受體在Li-pilocarpine模型SE過程中的表達變化，并觀察5-HT1A受體激活后對SE過程中ERK通路活化的作用。
　　方法:
　　1.250-300g SD大鼠建立Li-pilocarpine模型。在pilocarpine給藥后0小時，1小時，2小時，6小時和24小時留取海馬和腦干的石蠟切片標本和蛋白組織標本，分別用于對5-HT1A受

19、體的免疫組化和Western blot檢測。
　　2.經微波修復后，進行免疫組化染色。切片在顯微鏡下拍照后將圖片導入Image-Pro Plus6.0圖像分析軟件，測算陽性細胞數(shù)、陽性面積和平均光密度值。
　　3.通過Western blot方法半定量檢測5-HT1A受體在各時間點的表達變化。
　　4.用于ERK通路研究的大鼠根據(jù)體重配比分為4組，組1:空白對照組:在給予氯化鋰后24小時，給予磷酸鹽緩沖液(PBS)1m

20、L/kg替代pilocarpine注射;組2:單純Li-pilocarpine模型組;組3:皮下激動劑干預組:建立Li-pilocarpine模型，并在pilocarpine注射前1小時皮下注射激動劑8-OH-DAPT1.0 mg/kg;組4:皮下激動劑合并拮抗劑干預組:建立Li-pilocarpine模型，并在pilocarpine注射前1小時前皮下激動劑8-OH-DPAT0.01mg/kg注射后即刻給予拮抗劑WAY-1006351.

21、0mg/kg注射。分別在pilocarpine給藥后0小時，1小時，2小時，6小時和24小時留取海馬蛋白標本。
　　4.通過Western blot方法半定量檢測pERK1/2和ERK1/2在各時間點的表達變化。
　　結果:
　　1.腦干5-HT1A受體主要表達在中縫背核（DRN）和中央上核（MRN），分布在5-HT神經元細胞膜上，少部分在胞漿中可見。5-HT1A受體在pilocarpine注射后1小時表達增加，但進入

22、SE晚期（6小時和24小時）表達減少。其中DRN受體變化的幅度大于MRN。
　　2.海馬5-HT1A受體分布在CA1區(qū)，CA3區(qū)和DG區(qū)的錐體細胞和顆粒細胞膜上，但表達濃度不高。海馬受體在pilocarpine注射后2小時表達增多，但在SE晚期期（6小時和24小時）表達下降。
　　3.Li-pilocarpine模型組pERK/ERK值顯著高于空白對照組。其中以pERK2變化為主，在整個SE過程中持續(xù)增高。而pERK1僅在S

23、E晚期升高明顯。激動劑使pERK1/ERK1和pERK2/ERK2在SE過程各時間點均較低，而合并拮抗劑組該作用消失。
　　結論:
　　1.腦干中縫核區(qū)5-HT1A受體表達在pilocarpine注射后1小時升高，SE后期表達下降。DRN受體密度變化程度大于MRN。
　　2.海馬5-HT1A受體在pilocarpine注射后2小時表達增高，后期表達明顯減少。5-HT1A受體表達改變與神經元密度變化不完全相關。