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文檔簡(jiǎn)介
1、豬傳染性胸膜肺炎(PorcineContagiousPleuropneumonia,PCP)是由胸膜肺炎放線桿菌(Actinobacilluspleuropneumoniae,APP)引起的一種高度接觸傳染的呼吸道疾病。豬瘟(Swinefever,SF),歐洲人稱為古典豬瘟(Classicalswinefever,CSF),是由豬瘟病毒(Classicalswinefevervirus,CSFV)引起的一種高度接觸性和致死性傳染病。這兩
2、種重要的病原微生物所引起的疾病已經(jīng)給全世界的養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。 隨著高通量測(cè)序技術(shù)的發(fā)展,越來(lái)越多的基因組序列被測(cè)序完成,對(duì)基因組序列的比較分析為探索微生物的遺傳變異提供了一個(gè)嶄新的機(jī)會(huì)。我們利用生物信息學(xué)的分析方法和策略,對(duì)以上2種病原微生物的基因組序列進(jìn)行了深入地比較與分析,描述了基因組序列結(jié)構(gòu)與病原的致病能力/代謝機(jī)制之間的關(guān)系。主要的研究?jī)?nèi)容包括: 1.APP的基因組測(cè)序與分析目前,APP根據(jù)表面脂多糖
3、和莢膜多糖的不同劃分成至少15個(gè)血清型,不同血清型菌株的毒力、抗原性和地域分布不盡相同。APP血清型的這些特點(diǎn)為發(fā)展安全有效的疫苗和簡(jiǎn)易的診斷方法帶來(lái)了困難。 APP代謝和致病的分子機(jī)制一直以來(lái)都是獸醫(yī)界和診斷醫(yī)學(xué)界研究的熱點(diǎn)。但是APP基因組信息的缺乏已成為制約該細(xì)菌研究技術(shù)發(fā)展的瓶頸。因此,解析我國(guó)流行的優(yōu)勢(shì)血清3型APP的全基因組序列,不僅為國(guó)際APP基因組計(jì)劃提供了“參考序列”,而且為該病防治技術(shù)的研究提供了理論依據(jù)和研
4、究材料。 在本研究中,我們對(duì)一株在中國(guó)流行的優(yōu)勢(shì)血清3型APPJL03株進(jìn)行了基因組測(cè)序,并且首次對(duì)APP進(jìn)行了全面的功能注釋和分析比較。完成測(cè)序的JL03基因組由一個(gè)長(zhǎng)度為2,242,062bp的染色體組成,一共預(yù)測(cè)出2097個(gè)蛋白質(zhì)的編碼序列,6個(gè)核糖體rRNA操縱子和63個(gè)tRNA基因(GenBank登陸號(hào):CP000687)。另外,加拿大測(cè)序完成的APP血清5b型L20株的長(zhǎng)度約為2.27Mbp,含有2012個(gè)CDS:而
5、部分測(cè)序的APP血清1型4074株序列包含140個(gè)連接群(contig),長(zhǎng)約2.07Mbp,含有2132個(gè)CDS。在三個(gè)已測(cè)序的APP菌株中,JL03株為低毒力株,L20和4074株均為強(qiáng)毒株。 通過(guò)APP三個(gè)菌株間以及APP與巴斯德菌科其他物種的比較基因組學(xué)的研究,詳細(xì)描述了APP的代謝機(jī)制和致病性/毒力的特征。確認(rèn)了APP代謝通路上的一系列基因,證實(shí)APP可以通過(guò)發(fā)酵和呼吸(有氧呼吸和無(wú)氧呼吸)兩種方式產(chǎn)生能量(ATP),
6、并且為闡明這一復(fù)雜的代謝網(wǎng)絡(luò)提供了一個(gè)全面的遺傳基礎(chǔ)。在JL03基因組中,鑒定出一些特征性的基因組島:同化硫還原基因串;F1p鞭毛合成基因串,參與細(xì)菌黏附作用;莢膜多糖合成基因串,參與細(xì)菌莢膜多糖的合成;脂多糖O抗原基因串,參與細(xì)菌O抗原的合成。同時(shí),我們發(fā)現(xiàn)在L20株中存在一個(gè)37.7kb的基因組島,其上編碼了8個(gè)噬菌體相關(guān)基因,該島未在JL03株中發(fā)現(xiàn)。這些基因組島的發(fā)現(xiàn)為進(jìn)一步研究APP血清多樣性的機(jī)制提供了基礎(chǔ)。 另外,
7、我們描述了與細(xì)菌毒力相關(guān)的一整套基因,JL03株中的某些基因發(fā)生了遺傳上的丟失或者不同類型的突變。以上分析證實(shí)了以往對(duì)該病原毒力決定簇的認(rèn)識(shí),為解釋不同血清型菌株之間毒力的差異提供了理論依據(jù)。 總之,APP基因組序列結(jié)構(gòu)的解析和編碼蛋白質(zhì)功能的初步分析不僅證實(shí)了該菌部分生理生化的表型特征,并且為探索這個(gè)重要病原菌的毒力和代謝的特征提供了新的研究設(shè)想。 2.CSFV的基因組測(cè)序與分析CSFV屬于黃病毒科瘟病毒屬,只有單一的
8、血清型,是一種單正鏈的RNA病毒。在本研究中,我們對(duì)一株分離自中國(guó)河南的CSFVSWH/CA/2004株進(jìn)行了基因組測(cè)序和分析比較。SWH/CA/2004基因組cDNA的序列長(zhǎng)度為12296nt(GenBank登陸號(hào):DQ127910),5'NTR長(zhǎng)度為373nt,3'NTR的長(zhǎng)度為226nt以及一個(gè)開放讀碼框,編碼一個(gè)3898個(gè)氨基酸的聚蛋白前體。對(duì)SWH/CA/2004株與其它已報(bào)道的CSFV株進(jìn)行基因組的序列比對(duì)和進(jìn)化分析后發(fā)現(xiàn):
9、不同株基因組的核苷酸的相似性在92.4%-97.9%之間,氨基酸的相似性在96.1%-98.4%之間。SWH/CA/2004與中國(guó)強(qiáng)毒株cF114/CA/2001株的遺傳距離最接近,為0.013;而與中等毒力的GXWZ02/CA/2003株的遺傳距離較遠(yuǎn),為0.170。 我們?nèi)胬煤头治隽爽F(xiàn)有的不同地區(qū)來(lái)源的豬瘟病毒全長(zhǎng)基因組的序列信息,揭示出CSFV的系統(tǒng)發(fā)生關(guān)系,為研究豬瘟病毒的遺傳變異和分子流行病學(xué)提供了參考材料和研究基
10、礎(chǔ)。 3.黃病毒科RNA聚合酶表達(dá)抑制的研究黃病毒科的依賴于RNA的RNA聚合酶(RNA-dependentRNApolymerase,RdRp)參與組成病毒的復(fù)制酶復(fù)合體,在病毒的復(fù)制循環(huán)中發(fā)揮重要的作用。在本研究中,針對(duì)三種病毒的RNA聚合酶基因高度保守的MotifV區(qū)域設(shè)計(jì)了相應(yīng)的小干擾RNA分子(smallinterferingRNA,siRNA),用來(lái)研究siRNA分子在調(diào)控RNA聚合酶表達(dá)過(guò)程中的作用。 我們
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