骨形態(tài)形成蛋白4對(duì)大鼠遠(yuǎn)端肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度影響及其機(jī)制初步研究.pdf

1、目的：探討骨形態(tài)形成蛋白4（BMP4）對(duì)大鼠遠(yuǎn)端肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度的影響及其機(jī)制，為進(jìn)一步探究其在低氧性肺動(dòng)脈高壓（HPH）發(fā)病過程的可能作用與機(jī)制打下基礎(chǔ)。
　　 研究內(nèi)容和方法：
　　 一、BMP4對(duì)大鼠遠(yuǎn)端肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度的影響
　　 將200-300g雄性Wistar大鼠麻醉后,取出心肺組織,置于顯微鏡下，用顯微鑷和顯微剪刀于顯微鏡下小心分離出遠(yuǎn)端(4-5級(jí))肺動(dòng)脈,剝離內(nèi)外膜后,采

2、用膠原酶消化法獲得遠(yuǎn)端肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞,將細(xì)胞種于放置在35mm培養(yǎng)皿內(nèi)的圓形載玻片上,培養(yǎng)至第三天細(xì)胞密度達(dá)到50％,將細(xì)胞隨機(jī)分為三個(gè)組:(1)未處理組,未給予刺激物; (2)對(duì)照組,用等量的BMP4溶解緩沖液處理PASMCs 60h; (3)BMP4組,用BMP4(50ng/ml)處理PASMCs60h。細(xì)胞用Fura-2在細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)孵育1h，使Fura-2進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，用熒光顯微鏡檢測(cè)，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線，推算細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度。

3、r>　　 二、大鼠遠(yuǎn)端肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞TRPC1,6 mRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)及其機(jī)理研究
　　 1、BMP4對(duì)PSMC表達(dá)TRPC1、6 mRNA和蛋白質(zhì)的影響：實(shí)驗(yàn)采用原代培養(yǎng)大鼠遠(yuǎn)端肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞，培養(yǎng)至第五天細(xì)胞密度達(dá)到80-90％,將細(xì)胞隨機(jī)分為三個(gè)組:(1)未處理組,未給予刺激物；(2)對(duì)照組,用等量的BMP4溶解緩沖液處理PASMCs 60h；(3)BMP4組,用BMP4(50ng/ml)處理PASMCs60h。收

4、集細(xì)胞，用iQ SYBR Green supermix試劑實(shí)時(shí)定量細(xì)胞中的TRPC1,6 mRNA的表達(dá)；用Western Blotting檢測(cè)TRPC1,6 蛋白質(zhì)的表達(dá)。
　　 2、BMP4對(duì)Smad1/5/8，ERK1/2，p38MAPK 信號(hào)通路的影響：原代培養(yǎng)大鼠遠(yuǎn)端肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞，培養(yǎng)至第五天細(xì)胞密度達(dá)到80-90％,將細(xì)胞隨機(jī)分為七個(gè)組:(1) 對(duì)照組,用等量的BMP4溶解緩沖液處理PASMCs15min；(2)

5、BMP4(50ng/ml)處理組: 分別用BMP4(50ng/ml)處理PASMCs15min、30min、1h、4h、8h、60h。收集細(xì)胞，用Western Blotting檢測(cè)BMP4對(duì)Smad1/5/8，ERK1/2，p38MAPK 信號(hào)通路的影響。
　　 3、BMPRⅡSiRNA、SB及PD對(duì)BMP4/Smad1/5/8，ERK1/2，p38MAPK 信號(hào)通路的影響：用Western Blotting檢測(cè)BMPRⅡ-S

6、iRNA、PD和SB對(duì)BMP4刺激Smad1/5/8、ERK1/2和p38MAPK信號(hào)通路的影響。
　　 4、SB及PD對(duì)BMP4促進(jìn)大鼠遠(yuǎn)端PSMCs表達(dá)TPRC1,6mRNA和蛋白質(zhì)的干預(yù)作用：原代培養(yǎng)大鼠遠(yuǎn)端肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞，培養(yǎng)至第五天細(xì)胞密度達(dá)到80-90％,將細(xì)胞隨機(jī)分為四個(gè)組:(1) 空白對(duì)照組，細(xì)胞未給予任何刺激物；(2) DMS0對(duì)照組，DMSO預(yù)處理細(xì)胞30min，BMP4(50ng/ml)處理PASMCs6

7、0h；(3)SB組，SB(5μM)預(yù)處理細(xì)胞30min，BMP4(50ng/ml)處理PASMCs60h；(4)PD組，PD(10μM)預(yù)處理細(xì)胞30min，BMP4(50ng/ml)處理PASMCs60h；收集細(xì)胞，用iQ SYBR Green supermix試劑實(shí)時(shí)定量細(xì)胞中的TRPC1,6 mRNA的表達(dá)，用Western Blotting檢測(cè)TRPC1,6 蛋白質(zhì)的表達(dá)。
　　 5、SB或PD對(duì) BMP4增加PSMCs

8、內(nèi)鈣離子濃度的影響的研究：原代培養(yǎng)大鼠遠(yuǎn)端肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞，培養(yǎng)至第三天細(xì)胞密度達(dá)到50％,將細(xì)胞隨機(jī)分為四個(gè)組：1) 空白對(duì)照組，細(xì)胞未給予任何刺激物；(2) DMS0對(duì)照組，DMSO預(yù)處理細(xì)胞30min，BMP4(50ng/ml)處理PASMCs60h；(3)SB組，SB(5μM)預(yù)處理細(xì)胞30min，BMP4(50ng/ml)處理PASMCs60h (4)PD組，PD(10μM)預(yù)處理細(xì)胞30min，BMP4(50ng/ml)處理

9、PASMCs60h。細(xì)胞用Fura-2孵育，使Fura-2進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，用熒光顯微鏡檢測(cè)，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線，推算細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度。
　　 三、慢性低氧對(duì)小鼠肺組織內(nèi)BMP內(nèi)源性拮抗蛋白表達(dá)的影響
　　 實(shí)驗(yàn)選用雄性的BMP4基因敲除的同種系BMP4+/+C57BL/6J純合子小鼠和BMP4+/-C57BL/6J雜合子小鼠，將BMP4+/+C57BL/6J小鼠隨機(jī)分為5組（n=3或4）：即正常對(duì)照組、低氧1天組、低氧3天組、低

10、氧7天組和低氧21天組。6只BMP4+/-C57BL/6J小鼠隨機(jī)分成低氧1天和對(duì)照2組。將低氧小鼠置于低氧裝置內(nèi)，調(diào)節(jié)箱內(nèi)氧濃度為10％，每天24小時(shí)持續(xù)低氧。對(duì)照組小鼠除吸入空氣外，其它飼養(yǎng)條件與實(shí)驗(yàn)組相同。低氧完成后，麻醉小鼠取出心肺組織，左肺儲(chǔ)存于-80。C冰箱備用，右肺組織提取總RNA；用實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)BMP內(nèi)源性拮抗蛋白的mRNA表達(dá)水平。
　　 結(jié)果：
　　 一、BMP4能夠增加大鼠遠(yuǎn)端PASMCs內(nèi)鈣

11、離子濃度，未處理組、僅以溶解液處理對(duì)照組和50ng/ml BMP4處理組，[Ca2+]I分別為 204.07±1.22nM; 170.64±0.68nM; 415.52±3.94nM，實(shí)驗(yàn)組PASMC內(nèi)鈣離子濃度明顯高于對(duì)照組，P值〈0.05。
　　 二、BMP4能夠促進(jìn)大鼠遠(yuǎn)端PASMCs的TRPC1、6mRNA及蛋白的表達(dá)，未處理組和對(duì)照組比較無差異表達(dá)，與對(duì)照組比較BMP4組TRPC1,TRPC6mRNA表達(dá)量明顯升高，分

12、別上升1.69倍，2.08倍（P〈0.05)，BMP4組與對(duì)照組相比,BMP4分別使TRPC1/β-actin,TRPC6/β-actin的蛋白灰度比值增加1.61倍,1.41倍（P〈0.05)，結(jié)果具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 三、BMP4作用于大鼠遠(yuǎn)端PASMCs,可以迅速激活Smad信號(hào)通路(15min),而后隨時(shí)間的延長逐漸減弱，也可以迅速激活P38MAPK及ERK1/2信號(hào)通路(15min),并且在作用4h時(shí)出現(xiàn)第二個(gè)激活高

13、峰。
　　 四、BMPRⅡsiRNA轉(zhuǎn)染大鼠遠(yuǎn)端PASMCs,成功地沉默了BMPRⅡ蛋白表達(dá)的同時(shí),減弱了BMP4對(duì)Smad磷酸化水平。
　　 五、P38MAPK信號(hào)通路的特異性抑制劑SB及ERK1/2信號(hào)通路的特異性抑制劑PD能夠降低BMP4刺激所引起的TRPC1、6mRNA的表達(dá)，用ERK1/2的抑制劑PD處理組TRPC1和TPC6mRNA的相對(duì)表達(dá)量分別降低1.6倍和1.7倍（P〈0.05)；用P38MAPK的抑制

14、劑SB處理組TRPC1和TPC6mRNA的相對(duì)表達(dá)量分別降低1.5。
　　 六、P38MAPK信號(hào)通路的特異性抑制劑SB及ERK1/2信號(hào)通路的特異性抑制劑PD能夠降低BMP4刺激所引起的TRPC1、6蛋白表達(dá)增加，SB+B4、PD+B4與DMSO+B4組比較TRPC1蛋白表達(dá)TRPC1/β-actin的灰度比值分別下降2.3倍（P〈0.05)；SB+B4、PD+B4與DMSO+B4組比較TRPC6蛋白表達(dá)TRPC6/β-act

15、in的灰度比值分別下降2.7倍（P〈0.05)。
　　 七、P38MAPK信號(hào)通路的特異性抑制劑SB及ERK1/2信號(hào)通路的特異性抑制劑PD均能夠降低BMP4對(duì)大鼠遠(yuǎn)端PASMCs內(nèi)基礎(chǔ)Ca2+濃度增加的程度，用ERK1/2的抑制劑PD和P38MAPK的抑制劑SB處理的PASMCs內(nèi)這種BMP4誘導(dǎo)的Ca2+濃度增加分別降低1.9倍和1.6倍(P〈0.05)。
　　 八、在正常的BMP4+/+C57BL/6J小鼠肺組織中

16、至少存在8種BMP內(nèi)源性拮抗劑，分別是chordin、chordin-1、Noggin、Mgp、FSRP、CV-2、Fst和Gremlin。
　　 九、8種BMP內(nèi)源性拮抗蛋白的mRNA的表達(dá)隨小鼠缺氧的時(shí)間呈先上升后下降的趨勢(shì)，低氧第一天表達(dá)增加尤其明顯，其中FSN的表達(dá)趨勢(shì)較其他幾種BMP內(nèi)源性拮抗蛋白明顯,別增加3.64倍、1.23倍、2.0倍、2.0倍、1.9倍、2.8倍、1.4倍、28倍(P〈0.05)。
　　

17、 十、常氧狀態(tài)下，BMP4+/+C57BL/6J純合子小鼠和BMP4+/-C57BL/6J雜合子小鼠肺組織內(nèi)大多數(shù)BMP內(nèi)源性拮抗蛋白mRNA的表達(dá)無明顯差異，兩組對(duì)照，BMP4+/-雜合子小鼠肺組織內(nèi)Noggin和 CV2 mRNA的表達(dá)上升,分別為1.36倍、1.91倍(P〈0.05)，chordin mRNA的表達(dá)降低,下降0.59倍。
　　 結(jié)論：
　　 一、BMP4促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度增加是低氧性肺動(dòng)脈高壓發(fā)

18、病機(jī)制中新的觀點(diǎn)。BMP4可以激活Smad、P38MAPK和ERK1/2信號(hào)通路。BMP4可以通過激活P38MAPK，ERK1/2途徑，刺激大鼠遠(yuǎn)端PASMCs的TRPC1，6mRNA及蛋白的表達(dá)增加，通過TRPC1，6組成的Ca2+通道增加細(xì)胞內(nèi)的Ca2+濃度，從而增加血管的緊張度及促進(jìn)血管平滑肌增殖，最終導(dǎo)致肺動(dòng)脈高壓。
　　 二、低氧條件下，細(xì)胞首先表現(xiàn)出應(yīng)激反應(yīng)，增加BMP內(nèi)源性拮抗蛋白的表達(dá)，隨后出現(xiàn)與BMP不協(xié)調(diào)的表