NOX4介導(dǎo)BMP4引起的大鼠肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞內(nèi)TRPC1,6蛋白上調(diào).pdf

1、【研究背景】
　　肺動(dòng)脈高壓(pulmonary arterial hypertension,PAH)是一大類(lèi)主要以肺動(dòng)脈壓力和肺血管阻力增高為臨床特點(diǎn)的病理生理綜合征。其發(fā)病的主要病理機(jī)制,早期以肺動(dòng)脈痙攣收縮為主,后期則出現(xiàn)肺動(dòng)脈內(nèi)、中、外膜增殖肥厚,導(dǎo)致管腔狹窄為主的血管重塑,整個(gè)病理過(guò)程伴或不伴有血管內(nèi)原位血栓形成。肺動(dòng)脈壁各層,尤其是肺動(dòng)脈中層出現(xiàn)平滑肌增殖肥厚,以及原先本無(wú)平滑肌層的微動(dòng)脈出現(xiàn)平滑肌肌化,并最終導(dǎo)致官腔

2、狹窄,是肺動(dòng)脈高壓形成過(guò)程中最主要的病理表現(xiàn)。深入研究肺小動(dòng)脈及微動(dòng)脈平滑肌增殖肥厚的內(nèi)在機(jī)制,進(jìn)而開(kāi)發(fā)可以阻斷或者逆轉(zhuǎn)此過(guò)程藥物,必將對(duì)肺動(dòng)脈高壓的防治起到積極的推動(dòng)作用。研究表明活性氧(reactive oxygen species,ROS)在慢性低氧性肺動(dòng)脈高壓(chronic hypoxic pulmonary hypertension,CHPH)的肺血管增殖和重塑過(guò)程中起著重要作用。而在肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞(pulmonary a

3、rterial smooth muscle cells,PASMCs)中,ROS主要是由煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(nicotinamide-adenine dinucleotide phosphate,NADPH)氧化酶(oxidase)4(NOX4)通過(guò)生物細(xì)胞膜傳遞電子產(chǎn)生。近年研究發(fā)現(xiàn),作為轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β(transforming growth factor β,TGF-β)超家族成員的骨形態(tài)發(fā)生蛋白4(bone morphog

4、enetic protein 4,BMP4)低濃度時(shí)可以促進(jìn)大鼠PASMCs增殖,而在某些誘導(dǎo)因素存在條件下還可以抑制PASMCs凋亡,BMP4在CHPH血管重塑發(fā)生發(fā)展過(guò)程中起著重要作用。我們的研究發(fā)現(xiàn),在CHPH中BMP4通過(guò)上調(diào)大鼠肺動(dòng)脈和PASMCs內(nèi)經(jīng)典瞬時(shí)受體電位通道(transient receptor potential canonical channel,TRPC)蛋白1、6(TRPC1、TRPC6)的表達(dá),使PASM

5、Cs內(nèi)基礎(chǔ)鈣離子濃度([Ca2+]i)和鈣池操縱性鈣內(nèi)流(store operated calcium entry,SOCE)增加,繼而導(dǎo)致肺微小動(dòng)脈痙攣收縮和重塑,最終使肺動(dòng)脈阻力和肺動(dòng)脈壓增高。但BMP4如何誘導(dǎo)TRPC的表達(dá),繼而導(dǎo)致肺血管重塑的機(jī)制仍然不明。最近的研究證實(shí)在PASMCs中TGF-β誘導(dǎo)的NOX4表達(dá)和ROS生成與增殖明顯相關(guān)。BMP4是否通過(guò)上調(diào)大鼠PASMCs NOX4表達(dá),從而影響ROS生成,并進(jìn)一步調(diào)控細(xì)胞

6、內(nèi)鈣穩(wěn)態(tài)和肺血管重塑,參與肺動(dòng)脈高壓的形成,有關(guān)研究未見(jiàn)報(bào)道。
　　【研究目的】
　　本實(shí)驗(yàn)建立了大鼠遠(yuǎn)端PASMCs原代培養(yǎng)模型,觀察重組BMP4蛋白對(duì)BMP4基因敲除小鼠PASMCs中NOX4蛋白和的ROS水平影響;觀察BMP4基因敲除小鼠肺動(dòng)脈平滑肌組織中NOX4蛋白表達(dá)情況;構(gòu)建NOX4基因沉默序列,觀察BMP4是否通過(guò)NOX4對(duì)PASMCs中ROS水平起的作用;觀察重組BMP4蛋白對(duì)PASMCs的增殖和TRPC1,

7、6的表達(dá)的影響;從而探討B(tài)MP4調(diào)節(jié)PASMCs中鈣穩(wěn)態(tài)和肺血管重塑的機(jī)制,為防治肺動(dòng)脈高壓尋找有效靶點(diǎn)。
　　【研究方法】
　　本文主要采用原代細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)并輔以轉(zhuǎn)基因小鼠動(dòng)物實(shí)驗(yàn)。
　　(1)分離大鼠和BMP4基因敲除小鼠肺動(dòng)脈平滑肌組織,培養(yǎng)原代大鼠遠(yuǎn)端PASMCs;觀察細(xì)胞形態(tài)及熒光共聚焦α-actin染色鑒定大鼠肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞;Genotyping鑒定BMP4基因敲除雜合子和野生型小鼠;Western bl

8、otting(蛋白質(zhì)免疫印跡)檢測(cè)PASMCs和肺動(dòng)脈平滑肌組織NOX4蛋白;構(gòu)建NOX4siRNA,細(xì)胞轉(zhuǎn)染后Western blotting檢測(cè)其效率;流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)大鼠肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞內(nèi)ROS水平。
　　(2)MTT法檢測(cè)沉默NOX4基因后大鼠遠(yuǎn)端PASMCs增殖;Western blotting檢測(cè)NOX4基因沉默后TRPC1,6蛋白表達(dá)。
　　【實(shí)驗(yàn)結(jié)果】
　　1、構(gòu)建了原代大鼠遠(yuǎn)端PASMCs細(xì)胞模型,大鼠

9、遠(yuǎn)端PASMCs無(wú)論在形態(tài)學(xué)還是免疫學(xué)上都表現(xiàn)出典型的特征,且生理功能良好;成功建立BMP4基因敲除雜合子小鼠;體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)證實(shí)BMP4可誘導(dǎo)大鼠遠(yuǎn)端PASMCs及肺動(dòng)脈平滑肌組織中NOX4蛋白表達(dá);重組BMP4蛋白上調(diào)大鼠遠(yuǎn)端PASMCs ROS平均水平;成功構(gòu)建NOX4siRNA,轉(zhuǎn)染NOX4siRNA后大鼠遠(yuǎn)端PASMCs NOX4蛋白低表達(dá);重組BMP4蛋白不能上調(diào)NOX4敲除后大鼠遠(yuǎn)端PASMCs中ROS平均水平。
　　2

10、、NOX4阻斷BMP4誘導(dǎo)的大鼠遠(yuǎn)端PASMCs中TRPC1的上調(diào);NOX4阻斷BMP4誘導(dǎo)的大鼠遠(yuǎn)端PASMCs中TRPC6的上調(diào);NOX4阻斷BMP4誘導(dǎo)的大鼠遠(yuǎn)端PASMCs細(xì)胞增殖。
　　【實(shí)驗(yàn)結(jié)論】
　　1.BMP4上調(diào)大鼠遠(yuǎn)端肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞中NOX4蛋白的表達(dá)和ROS水平。
　　2.BMP4上調(diào)大鼠遠(yuǎn)端肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞ROS水平是通過(guò)NOX4介導(dǎo)的。
　　3.BMP4通過(guò)NOX4介導(dǎo)促進(jìn)大鼠遠(yuǎn)端肺動(dòng)