NOX4介導BMP4引起的大鼠肺動脈平滑肌細胞內(nèi)TRPC1,6蛋白上調.pdf

1、【研究背景】
　　肺動脈高壓(pulmonary arterial hypertension,PAH)是一大類主要以肺動脈壓力和肺血管阻力增高為臨床特點的病理生理綜合征。其發(fā)病的主要病理機制,早期以肺動脈痙攣收縮為主,后期則出現(xiàn)肺動脈內(nèi)、中、外膜增殖肥厚,導致管腔狹窄為主的血管重塑,整個病理過程伴或不伴有血管內(nèi)原位血栓形成。肺動脈壁各層,尤其是肺動脈中層出現(xiàn)平滑肌增殖肥厚,以及原先本無平滑肌層的微動脈出現(xiàn)平滑肌肌化,并最終導致官腔

2、狹窄,是肺動脈高壓形成過程中最主要的病理表現(xiàn)。深入研究肺小動脈及微動脈平滑肌增殖肥厚的內(nèi)在機制,進而開發(fā)可以阻斷或者逆轉此過程藥物,必將對肺動脈高壓的防治起到積極的推動作用。研究表明活性氧(reactive oxygen species,ROS)在慢性低氧性肺動脈高壓(chronic hypoxic pulmonary hypertension,CHPH)的肺血管增殖和重塑過程中起著重要作用。而在肺動脈平滑肌細胞(pulmonary a

3、rterial smooth muscle cells,PASMCs)中,ROS主要是由煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(nicotinamide-adenine dinucleotide phosphate,NADPH)氧化酶(oxidase)4(NOX4)通過生物細胞膜傳遞電子產(chǎn)生。近年研究發(fā)現(xiàn),作為轉化生長因子-β(transforming growth factor β,TGF-β)超家族成員的骨形態(tài)發(fā)生蛋白4(bone morphog

4、enetic protein 4,BMP4)低濃度時可以促進大鼠PASMCs增殖,而在某些誘導因素存在條件下還可以抑制PASMCs凋亡,BMP4在CHPH血管重塑發(fā)生發(fā)展過程中起著重要作用。我們的研究發(fā)現(xiàn),在CHPH中BMP4通過上調大鼠肺動脈和PASMCs內(nèi)經(jīng)典瞬時受體電位通道(transient receptor potential canonical channel,TRPC)蛋白1、6(TRPC1、TRPC6)的表達,使PASM

5、Cs內(nèi)基礎鈣離子濃度([Ca2+]i)和鈣池操縱性鈣內(nèi)流(store operated calcium entry,SOCE)增加,繼而導致肺微小動脈痙攣收縮和重塑,最終使肺動脈阻力和肺動脈壓增高。但BMP4如何誘導TRPC的表達,繼而導致肺血管重塑的機制仍然不明。最近的研究證實在PASMCs中TGF-β誘導的NOX4表達和ROS生成與增殖明顯相關。BMP4是否通過上調大鼠PASMCs NOX4表達,從而影響ROS生成,并進一步調控細胞

6、內(nèi)鈣穩(wěn)態(tài)和肺血管重塑,參與肺動脈高壓的形成,有關研究未見報道。
　　【研究目的】
　　本實驗建立了大鼠遠端PASMCs原代培養(yǎng)模型,觀察重組BMP4蛋白對BMP4基因敲除小鼠PASMCs中NOX4蛋白和的ROS水平影響;觀察BMP4基因敲除小鼠肺動脈平滑肌組織中NOX4蛋白表達情況;構建NOX4基因沉默序列,觀察BMP4是否通過NOX4對PASMCs中ROS水平起的作用;觀察重組BMP4蛋白對PASMCs的增殖和TRPC1,

7、6的表達的影響;從而探討B(tài)MP4調節(jié)PASMCs中鈣穩(wěn)態(tài)和肺血管重塑的機制,為防治肺動脈高壓尋找有效靶點。
　　【研究方法】
　　本文主要采用原代細胞培養(yǎng)技術并輔以轉基因小鼠動物實驗。
　　(1)分離大鼠和BMP4基因敲除小鼠肺動脈平滑肌組織,培養(yǎng)原代大鼠遠端PASMCs;觀察細胞形態(tài)及熒光共聚焦α-actin染色鑒定大鼠肺動脈平滑肌細胞;Genotyping鑒定BMP4基因敲除雜合子和野生型小鼠;Western bl

8、otting(蛋白質免疫印跡)檢測PASMCs和肺動脈平滑肌組織NOX4蛋白;構建NOX4siRNA,細胞轉染后Western blotting檢測其效率;流式細胞術檢測大鼠肺動脈平滑肌細胞內(nèi)ROS水平。
　　(2)MTT法檢測沉默NOX4基因后大鼠遠端PASMCs增殖;Western blotting檢測NOX4基因沉默后TRPC1,6蛋白表達。
　　【實驗結果】
　　1、構建了原代大鼠遠端PASMCs細胞模型,大鼠

9、遠端PASMCs無論在形態(tài)學還是免疫學上都表現(xiàn)出典型的特征,且生理功能良好;成功建立BMP4基因敲除雜合子小鼠;體內(nèi)外實驗證實BMP4可誘導大鼠遠端PASMCs及肺動脈平滑肌組織中NOX4蛋白表達;重組BMP4蛋白上調大鼠遠端PASMCs ROS平均水平;成功構建NOX4siRNA,轉染NOX4siRNA后大鼠遠端PASMCs NOX4蛋白低表達;重組BMP4蛋白不能上調NOX4敲除后大鼠遠端PASMCs中ROS平均水平。
　　2

10、、NOX4阻斷BMP4誘導的大鼠遠端PASMCs中TRPC1的上調;NOX4阻斷BMP4誘導的大鼠遠端PASMCs中TRPC6的上調;NOX4阻斷BMP4誘導的大鼠遠端PASMCs細胞增殖。
　　【實驗結論】
　　1.BMP4上調大鼠遠端肺動脈平滑肌細胞中NOX4蛋白的表達和ROS水平。
　　2.BMP4上調大鼠遠端肺動脈平滑肌細胞ROS水平是通過NOX4介導的。
　　3.BMP4通過NOX4介導促進大鼠遠端肺動