重組腺病毒載體Ad-LMP-1的構(gòu)建及其轉(zhuǎn)染MSC后成骨活性檢測.pdf

1、研究背景： 骨質(zhì)疏松及其相關(guān)骨折嚴(yán)重影響老年人的生活質(zhì)量，并由此帶來巨大的經(jīng)濟(jì)和社會(huì)健康負(fù)擔(dān)；骨質(zhì)疏松及其骨折的治療多年以來一直是困繞骨科臨床醫(yī)生的難題之一，隨著我人口的老齡化，骨質(zhì)疏松及其骨折患者也將逐漸增加，因此尋找新的、療效切實(shí)可靠且具有突破性進(jìn)展的治療方法具有重大的現(xiàn)實(shí)意義。 骨質(zhì)疏松基本病理機(jī)制為骨吸收和形成(骨重建偶聯(lián))的失衡，骨形成的不足，或(和)骨吸收的增強(qiáng)導(dǎo)致骨量的減少，骨組織微結(jié)構(gòu)的退變、骨脆性增加和

2、骨強(qiáng)度下降，骨折的易感性增加，骨折后的愈合能力顯著降低。MSCs是成體干細(xì)胞之一，具有多向分化潛能，可分化為成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞和等多種細(xì)胞，骨質(zhì)疏松個(gè)體的MSCs數(shù)量減少，質(zhì)量也下降，增殖和成骨細(xì)胞分化能力減弱，成骨能力也顯著降低[1]。MSCs轉(zhuǎn)染相關(guān)誘導(dǎo)因子基因后，不僅其增殖能力沒有受到影響，而且可以加強(qiáng)其定向分化的能力，比如轉(zhuǎn)導(dǎo)入骨誘導(dǎo)基因后，能有效促進(jìn)骨的形成，修復(fù)骨缺損[2]，從而為骨質(zhì)疏松及其骨折的基因治療提供了一個(gè)新的平臺(tái)

3、。 骨誘導(dǎo)因子是一類可促進(jìn)局部或全身骨形成的的生物分子。LMP-1作為細(xì)胞內(nèi)信號(hào)分子，啟動(dòng)體內(nèi)骨的形成的同時(shí)，刺激包括多種BMPs在內(nèi)不同骨誘導(dǎo)因子合成和分泌，促進(jìn)臨近的細(xì)胞分化并直接參加骨膜或軟骨內(nèi)成骨[3]，為骨折的修復(fù)提供非常有利的環(huán)境，因此是理想的候選基因。MSCs的生物學(xué)特性表明它該基因最佳的載體。與其它慢性疾病不同，OP骨折的治療不必也不需要讓所轉(zhuǎn)染的基因長達(dá)數(shù)周或數(shù)月持續(xù)的表達(dá)直至疾病痊愈，因而使轉(zhuǎn)基因方法更加切實(shí)

4、可行。 目的： 利用重組腺病毒載體Ad—LMP-1體外轉(zhuǎn)染MSCs，通過對(duì)轉(zhuǎn)染前后細(xì)胞成骨活性的檢測，明確LMP-1基因的成骨促進(jìn)作用，為基因治療骨質(zhì)疏松做基礎(chǔ)研究 方法： 1.分離培養(yǎng)SD大鼠成骨細(xì)胞，提取提取總RNA，設(shè)計(jì)特異性引物并RT—PCR獲取LMP-1基因，電泳驗(yàn)證，切膠回收純化。 2.利用gateway技術(shù)構(gòu)建Ad—LMP-1重組腺病毒載體，并行相關(guān)酶切電泳以及測序驗(yàn)證。 3

5、.重組腺病毒載體在293A細(xì)胞中的包裝。并初步確定感染復(fù)數(shù)MOI 4.分離培養(yǎng)大鼠MSC細(xì)胞，鑒定。 5.利用重組腺病毒感染第三代MSC細(xì)胞，通過Western—bloting檢測LMP-1基因在MSCs中的表達(dá)；通過檢測堿性磷酸酶、膠原蛋白I、骨鈣素以及，驗(yàn)證LMP-1基因的成骨促進(jìn)作用。 結(jié)果： 1.成功體外分離培養(yǎng)SD大鼠成骨細(xì)胞以及提取總RNA，利用RT—PCR獲取LMP-1基因，通過電泳初步鑒定

6、。 2.成功構(gòu)建重組腺病毒載體AdLMP-1，通過酶切電泳以及測序驗(yàn)證完全正確。 3.通過兩次轉(zhuǎn)染293細(xì)胞，提取病毒DNA，PCR鑒定成功；成功確定重組腺病毒載體感染復(fù)數(shù)。 4.成功分離培養(yǎng)SD大鼠MSC細(xì)胞，并通過成脂、成骨誘導(dǎo)鑒定以及表面標(biāo)記物鑒定。 5.重組腺病毒感染MSC細(xì)胞后，可檢測LMP-1基因的表達(dá)，并且通過與對(duì)照組的比較，驗(yàn)證了LMP-1基因的成骨促進(jìn)作用。 結(jié)論： 利用