重組腺病毒VEGF編碼基因載體的構(gòu)建及轉(zhuǎn)染大鼠骨髓間質(zhì)干細(xì)胞效率的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、背景:
　　 血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factot,VEGF),也稱血管調(diào)理素(Vascutotropin)和血管通透因子(vascular permealility factor,VPF),是Ferrara等在1989年從牛垂體濾泡星狀細(xì)胞的條件培養(yǎng)基中純化出來的一種具有肝素結(jié)合活性的生長(zhǎng)因子,是在胚胎發(fā)生和創(chuàng)傷愈合過程中啟動(dòng)血管形成的一個(gè)高度特異性的有絲分裂原,能特異性地作用

2、于血管內(nèi)皮細(xì)胞,促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖[1],加速新生血管形成并增加血管通透性[2]。促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞間質(zhì)的膠原酶表達(dá),促進(jìn)血漿纖維蛋白原的外滲,導(dǎo)致纖維蛋白原的沉積。VEGF已應(yīng)用于治療缺血性疾病,如修改人體神經(jīng)干細(xì)胞基因充分表達(dá)VEGF治療大腦內(nèi)出血中風(fēng)[3],并且移植脂肪源性干細(xì)胞促進(jìn)VEGF合成促進(jìn)腦缺血疾病的血管再通[4]。VEGF在臨床的應(yīng)用有著更廣闊的前景。
　　 目的:
　　 1.構(gòu)建攜帶VEGF基因AdEas

3、y復(fù)制缺陷型重組腺病毒載體系統(tǒng)。
　　 2.大鼠骨髓間質(zhì)干細(xì)胞的培養(yǎng)。
　　 3.觀察rAd-VEGF轉(zhuǎn)染大鼠骨髓基質(zhì)細(xì)胞(BMSCs)后VEGF的表達(dá)情況。
　　 方法:
　　 1.從PCR2.1-VEGF質(zhì)粒中克隆出VEGFA基因的編碼序列。
　　 2.VEGFA基因插入腺病毒系統(tǒng)的穿梭載體pAdTrack—CMV中。
　　 3.在含有腺病毒骨架載體pAdeasy-1的大腸桿菌BJ51

4、83中進(jìn)行同源重組獲得重組子pAdeasy-1-VEGF。
　　 4.鑒定pAdeasy-1-VEGF,將pAdeasy-1-VEGF轉(zhuǎn)染人胚腎細(xì)胞(Ad293A細(xì)胞),獲得含VEGF基因的重組腺病毒(rAd—VEGF),熒光顯微鏡觀測(cè)綠色熒光蛋白(GFP)的表達(dá)。
　　 5.反復(fù)感染HEK293A細(xì)胞擴(kuò)增腺病毒,50％組織培養(yǎng)感染量法(TCID50)檢測(cè)病毒滴度。
　　 6.體外培養(yǎng)大鼠骨髓間質(zhì)干細(xì)胞。

5、　　 7.rAd—VEGF轉(zhuǎn)染骨髓基質(zhì)細(xì)胞,轉(zhuǎn)染后在熒光顯微鏡下觀察并采用ELISA法檢測(cè)VEGF的表達(dá)水平。
　　 結(jié)果:
　　 1.經(jīng)酶切鑒定,基因測(cè)序及綠色熒光觀察證實(shí)成功構(gòu)建出含有VEGF基因的腺病毒載體rAd—VEGF。
　　 2.擴(kuò)增得到1010PFU／ml高滴度重組腺病毒。
　　 3.rAd—VEGFA轉(zhuǎn)染骨髓基質(zhì)細(xì)胞后,ELISA檢測(cè)發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染組上清液中VEGF蛋白分泌量明顯高于對(duì)照組(P