小鼠成骨樣細(xì)胞和骨樣細(xì)胞在體外成脂分化的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：通過(guò)對(duì)小鼠成骨樣細(xì)胞MC3T3-E1和小鼠骨樣細(xì)胞MLO-Y4在體外成脂誘導(dǎo)條件下向脂肪細(xì)胞分化能力的探討研究，為骨質(zhì)疏松癥等骨量減少性疾病的發(fā)病機(jī)制提供理論基礎(chǔ)。
　　方法：（1）細(xì)胞培養(yǎng)：將成骨樣細(xì)胞MC3T3-E1培養(yǎng)于含10％FBS的α-MEM的培養(yǎng)基中，將骨樣細(xì)胞MLO-Y4培養(yǎng)于含5％FBS、5％CS的α-MEM培養(yǎng)基中，其中培養(yǎng)骨樣細(xì)胞MLO-Y4的培養(yǎng)瓶提前用0.15mg/ml鼠尾I型膠原包被1小時(shí)。隔天換液

2、，倒置相差顯微鏡下定期觀察各組細(xì)胞狀態(tài)及生長(zhǎng)狀況，待細(xì)胞密度達(dá)到70%時(shí)進(jìn)行傳代培養(yǎng)。（2）實(shí)驗(yàn)分組：將成骨樣細(xì)胞MC3T3-E1進(jìn)行成脂誘導(dǎo)培養(yǎng)，設(shè)為A1組，將骨樣細(xì)胞MLO-Y4進(jìn)行成脂誘導(dǎo)培養(yǎng)，設(shè)為B1組，并設(shè)立相應(yīng)對(duì)照 A2組和B2組；將第1次加入成脂誘導(dǎo)液的時(shí)間記為0天，倒置相差顯微鏡下定期觀察各組細(xì)胞狀態(tài)及生長(zhǎng)狀況。（3）油紅O染色：各組分別取第0、4、7、10、14天時(shí)的細(xì)胞樣本行油紅 O染色，鑒定脂肪細(xì)胞的生成。（4）T

3、G相對(duì)含量測(cè)定：各組分別取第0、4、7、10、14天時(shí)的細(xì)胞樣本，使用TG試劑盒測(cè)定細(xì)胞裂解液TG濃度，BCA蛋白定量法測(cè)定裂解液蛋白濃度，計(jì)算每組細(xì)胞各時(shí)間點(diǎn)TG相對(duì)含量。（5）各組分別取第0、4、7、10、14天時(shí)的細(xì)胞樣本，應(yīng)用實(shí)時(shí)定量 RT-PCR分別檢測(cè) A1組和A2組各時(shí)間點(diǎn)Runx2mRNA、ALPmRNA、PPAR-γmRNA、C/EBPαmRNA相對(duì)表達(dá)量，B1組和B2組各時(shí)間點(diǎn) SOSTmRNA、DMP1mRNA、P

4、PAR-γmRNA、C/EBPαmRNA相對(duì)表達(dá)量。（6）應(yīng)用F檢驗(yàn)（α＝0.05）分析，p<0.05，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)果：（1）倒置相差顯微鏡下觀察未成脂誘導(dǎo)培養(yǎng)的細(xì)胞生長(zhǎng)情況：24h后細(xì)胞均貼壁生長(zhǎng)。成骨樣細(xì)胞 MC3T3-E1為長(zhǎng)梭形、多角形，以長(zhǎng)梭形居多，有集落樣分布現(xiàn)象，表面有少許短的突觸與鄰近細(xì)胞連接。骨樣細(xì)胞 MLO-Y4則表現(xiàn)為星射狀或樹(shù)枝狀的細(xì)胞，表面有多個(gè)突觸與周?chē)?xì)胞相聯(lián)系。骨樣細(xì)胞MLO-Y4的突

5、觸比成骨樣細(xì)胞 MC3T3-E1的突觸長(zhǎng)且粗，且骨樣細(xì)胞 MLO-Y4更加立體。（2）倒置相差顯微鏡下觀察成脂誘導(dǎo)培養(yǎng)細(xì)胞生長(zhǎng)情況：A1組成脂誘導(dǎo)第7天時(shí)，即開(kāi)始表現(xiàn)出一定的脂肪細(xì)胞形態(tài)和特征，在第14天時(shí)更為顯著。B1組成脂誘導(dǎo)在第14天時(shí)才表現(xiàn)出一定的脂肪細(xì)胞形態(tài)和特征。對(duì)照A2組和B2組各時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞形態(tài)及大小未見(jiàn)明顯變化。（3）油紅O染色顯示：A1組隨著誘導(dǎo)時(shí)間增加，可見(jiàn)細(xì)胞形態(tài)由原來(lái)的長(zhǎng)梭形、多角形逐漸變?yōu)闄E圓形、圓形，胞內(nèi)可見(jiàn)

6、充滿紅染脂滴的細(xì)胞數(shù)目明顯增加，紅染的脂滴從細(xì)小顆粒逐漸變大并聚集，在第14天時(shí)表現(xiàn)出典型的脂肪細(xì)胞形態(tài)和特征；B1組于同樣條件下，在第14天時(shí)才表現(xiàn)出一定的脂肪細(xì)胞形態(tài)和特征。而A2組和B2組各時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞形態(tài)無(wú)明顯改變，未見(jiàn)紅染細(xì)胞。（4）TG相對(duì)含量檢測(cè)
　　結(jié)果：A1組隨著誘導(dǎo)時(shí)間增加細(xì)胞內(nèi)TG相對(duì)含量在第7、10、14天時(shí)逐步顯著增加；B1組于同樣條件下，細(xì)胞內(nèi) TG相對(duì)含量在第14天時(shí)顯著增加；A2組和B2組細(xì)胞內(nèi)TG相

7、對(duì)含量在各時(shí)間點(diǎn)均無(wú)顯著變化。（5）各組細(xì)胞相關(guān)基因表達(dá)結(jié)果：①A1組隨著誘導(dǎo)時(shí)間增加，Runx2mRNA相對(duì)表達(dá)量在第4、7、10天時(shí)逐步顯著減少；ALPmRNA相對(duì)表達(dá)量在第7、10、14天時(shí)逐步顯著減少；PPAR-γmRNA相對(duì)表達(dá)量在第4、7、10天時(shí)逐步顯著增加；C/EBPαmRNA相對(duì)表達(dá)量在第7、10、14天時(shí)逐步顯著增加；A2組上述各基因相對(duì)表達(dá)量在各時(shí)間點(diǎn)無(wú)顯著變化。②B1組隨著誘導(dǎo)時(shí)間增加，SOSTmRNA相對(duì)表達(dá)量

8、在第14天時(shí)顯著減少；DMP1mRNA相對(duì)表達(dá)量在第7、10、14天時(shí)逐步顯著減少；PPAR-γmRNA相對(duì)表達(dá)量在第7、10、14天時(shí)逐步顯著增加；C/EBPαmRNA相對(duì)表達(dá)量在第14天時(shí)顯著增加；B2組隨著時(shí)間增加，SOSTmRNA和DMP1mRNA相對(duì)表達(dá)量在第14天時(shí)均顯著減少；而PPAR-γmRNA和C/EBPαmRNA相對(duì)表達(dá)量在各時(shí)間點(diǎn)無(wú)顯著變化。
　　結(jié)論：1.在成脂誘導(dǎo)液作用下，成骨樣細(xì)胞和骨樣細(xì)胞可以誘導(dǎo)分化