MIP-3α聯(lián)合成骨誘導液誘導大鼠脂肪干細胞向成牙本質(zhì)樣細胞分化的實驗研究.pdf

1、因齲齒或牙周疾病導致的牙齒缺失是人群中的常見病、多發(fā)病，世界衛(wèi)生組織（WHO）將牙齒疾病列為人類發(fā)病率最高的三大非傳染性疾病之一。臨床常用的修復牙齒缺失的方法，如人工材料替代缺失牙齒等，會引起包括免疫排斥在內(nèi)的諸多不良反應。組織工程技術的出現(xiàn)及發(fā)展為牙齒再生提供了新的思路。牙髓干細胞（DPSCs）、牙周膜干細胞（PDLSCs）、牙囊干細胞（DFSCs）、根尖乳頭干細胞（SCAP）、人類脫落乳牙干細胞（SHEDs）等牙源性干細胞均表現(xiàn)出了

2、良好的牙向分化潛能，可用作牙齒組織工程的種子細胞，但因其在成人尤其是老年人中來源有限，限制了臨床應用；非牙源性干細胞，如骨髓基質(zhì)干細胞（BMSC），亦能夠形成牙齒樣及牙周樣組織，但其在臨床獲取相對不便，且BMSC隨著供體年齡增加其多項分化能力明顯下降，亦存在著諸多不利因素，制約了其在牙齒再生領域的應用。
　　脂肪干細胞（ASC）來源廣泛，取材方便，含量豐富，在體內(nèi)及體外試驗中均顯示出了良好的自我更新及多向分化潛能，并且其向礦化組織

3、分化的能力不受供體年齡的影響。因此，本實驗首先在體外分離、培養(yǎng)并鑒定了大鼠脂肪干細胞，然后探討了其向成牙本質(zhì)樣細胞分化的可能性及其條件，以期為牙齒組織工程種子細胞的研究提供新的思路。
　　方法
　　1.原代分離培養(yǎng)SD大鼠脂肪干細胞，采用倒置顯微鏡觀察細胞的形態(tài)和生長狀況。將原代細胞培養(yǎng)傳代純化至第三代后采用MTT法測細胞生長曲線，流式細胞儀檢測脂肪干細胞表面標志物。
　　2.取第三至四代生長狀態(tài)良好的大鼠脂肪干細胞，

4、TNE消化收獲細胞，接種于6孔板。分別以成骨及成脂誘導基誘導大鼠脂肪干細胞骨向及脂向分化。而后進行ALP染色、茜素紅染色及油紅O染色實驗。
　　3.消化收獲第三至四代生長狀況良好的大鼠脂肪干細胞，接種后用MIP-3α聯(lián)合成骨誘導基誘導。分別于第1、4、7天行ALP活性檢測，并以PR-PCR及WestenBlotting檢測成牙本質(zhì)細胞標志基因及蛋白。以常規(guī)培養(yǎng)基、成骨誘導培養(yǎng)基做為對照組。
　　結果
　　1.大鼠脂肪干

5、細胞生長狀態(tài)良好，MTT法測細胞生長曲線顯示大致“S”型。表面標志物CD29+、CD49d+、CD45-。
　　2.成骨誘導顯示2周時光鏡下可見部分細胞向心性聚集生長，胞質(zhì)內(nèi)可見高透光結節(jié)狀顆粒。ALP染色可見胞核周圍棕黑色顆粒。3周時茜素紅染色可見紅色鈣化結節(jié)。成脂誘導顯示1周時細胞周圍可見散在脂滴，并不斷增大。3周時油紅O染色可見胞質(zhì)分布大量紅色大小不一的圓形脂滴，胞核藍染位于細胞一側。成骨及成脂誘導表明本實驗使用的大鼠脂肪干

6、細胞具有多項分化潛能。
　　3.成牙本質(zhì)誘導實驗表明，大鼠脂肪干細胞經(jīng)誘導后ALP活性增高，且在mRNA水平表達成牙本質(zhì)標志基因及蛋白，高于成骨誘導液組（P<0.05）；并且表達量隨時間的推移而增加(P<0.05)。常規(guī)培養(yǎng)基組無成牙本質(zhì)標志基因及蛋白的表達。
　　結論
　　1.大鼠脂肪干細胞原代分離培養(yǎng)成功，具有良好的生長趨勢及自我更新能力。CD29+、CD49d+、CD45-提示本實驗所用細胞為比較單一的未分化的脂