版權(quán)說明:本文檔由用戶提供并上傳,收益歸屬內(nèi)容提供方,若內(nèi)容存在侵權(quán),請進(jìn)行舉報或認(rèn)領(lǐng)
文檔簡介
1、鴨圓環(huán)病毒被歸類于圓環(huán)病毒科圓環(huán)病毒屬,該病毒ORF3所編碼的蛋白功能目前尚未闡釋。為了制備針對該蛋白的單克隆抗體,給進(jìn)一步探索該蛋白功能提供素材,論文對本實驗室分離鑒定的DuCV ORF3基因開展了以下實驗:DuCV ORF3基因的生物信息學(xué)分析、ORF3基因的克隆表達(dá)及純化、單克隆抗體的制備、間接競爭ELISA方法的建立和應(yīng)用,結(jié)果如下:
1.DuCV ORF3的生物信息學(xué)分析
GH01株DuCV全長1988bp
2、,ORF3基因A、T、G、C含量分別為21.89%、25.25%、24.58%、28.28%,共297bp,位于全基因組第399至第103位堿基,編碼98個氨基酸,分子量約11.6 KD。該蛋白二級結(jié)構(gòu)中無規(guī)則卷曲占大部分,含量約為62.3%,α-螺旋和β-折疊結(jié)構(gòu)分別占31.6%和6.1%;沒有保守區(qū)、信號肽、跨膜區(qū),提示該蛋白可能是該病毒進(jìn)化的關(guān)鍵蛋白,且既不是分泌性蛋白也不是跨膜蛋白;有三個潛在的磷酸化位點,沒有糖基化位點;抗原表
3、位主要集中在第2~12、第35~40、第49~53、第62~65、第72~75、第77~84位氨基酸,免疫原性良好。
2.DuCV ORF3基因的克隆表達(dá)及純化
PCR特異性擴增ORF3基因后進(jìn)行T-A克隆,再用EcoRⅠ和XhoⅠ這兩種內(nèi)切酶消化后連接到表達(dá)載體上,成功構(gòu)建了重組原核表達(dá)載體:pET-32a-ORF3和pGEX-6p-ORF3。重組載體分別轉(zhuǎn)化進(jìn)Rosetta(DE3) E.coli菌后用IPTG成
4、功誘導(dǎo)表達(dá)了30 KD和35 KD的ORF3融合蛋白,與預(yù)期大小一致,對pET-32a-ORF3的最佳IPTG誘導(dǎo)濃度為0.8mM,而對pGEX-6p-ORF3是0.2mM,這兩種融合蛋白都主要是以包涵體的形式存在。利用Ni2+親和層析及包涵體洗滌和SDS-PAGE切膠回收相結(jié)合的方法分別純化pET-32a-ORF3和pGEX-6p-ORF3重組蛋白,得到了高純度的蛋白。Western Blot檢測顯示這兩種蛋白均能夠與鴨圓環(huán)病毒陽性血
5、清特異性結(jié)合,表明它們都具有免疫學(xué)活性。
3.DuCV ORF3單克隆抗體的制備
純化的pET-32a-ORF3蛋白經(jīng)梯度復(fù)性后以100μg/只腹腔注射Balb/c雌性小鼠進(jìn)行免疫,效價達(dá)到104后,將骨髓瘤細(xì)胞與其脾細(xì)胞按1∶4的比例混勻,在PEG4000作用下進(jìn)行融合反應(yīng)。用建立的間接ELISA法(最佳抗原包被濃度1μg/孔)篩選陽性細(xì)胞,融合率為25%。經(jīng)過3次有限稀釋,最終達(dá)到100%的陽性,獲得4株穩(wěn)定分泌
6、抗ORF3抗體的雜交瘤細(xì)胞(依次命名為1、2、3、4號)。利用ORF3陽性雜交瘤細(xì)胞制備腹水型抗體,抗體的效價在1∶25600~1∶102400之間,均為IgM亞類,并能夠與ORF3蛋白特異性結(jié)合。
4.間接競爭ELISA方法的建立與應(yīng)用
利用純化的pET-32a-ORF3融合蛋白作為包被抗原,建立了穩(wěn)定可靠的DuCV ORF3抗體的間接競爭ELISA免疫學(xué)檢測方法。利用棋盤滴定法優(yōu)化包被抗原和腹水單抗的最佳梯度,再
7、確定出最優(yōu)血清稀釋度、競爭作用時間和cut-off判定值。結(jié)果表明該方法的最佳條件為pET-32a-ORF3純化蛋白以1μg/孔包被,5%BSA封閉后,1∶800的DuCV陽性血清37℃放置30min,直接加入1∶4000的腹水型單克隆抗體,混勻后37℃競爭反應(yīng)40 min,HRP-羊抗鴨Ig G二抗孵育再TMB顯色。該檢測方法cut-off判定值為10.9%,只特異性的與DuCV陽性血清反應(yīng),靈敏度為血清稀釋1∶1600倍。將該方法與
溫馨提示
- 1. 本站所有資源如無特殊說明,都需要本地電腦安裝OFFICE2007和PDF閱讀器。圖紙軟件為CAD,CAXA,PROE,UG,SolidWorks等.壓縮文件請下載最新的WinRAR軟件解壓。
- 2. 本站的文檔不包含任何第三方提供的附件圖紙等,如果需要附件,請聯(lián)系上傳者。文件的所有權(quán)益歸上傳用戶所有。
- 3. 本站RAR壓縮包中若帶圖紙,網(wǎng)頁內(nèi)容里面會有圖紙預(yù)覽,若沒有圖紙預(yù)覽就沒有圖紙。
- 4. 未經(jīng)權(quán)益所有人同意不得將文件中的內(nèi)容挪作商業(yè)或盈利用途。
- 5. 眾賞文庫僅提供信息存儲空間,僅對用戶上傳內(nèi)容的表現(xiàn)方式做保護(hù)處理,對用戶上傳分享的文檔內(nèi)容本身不做任何修改或編輯,并不能對任何下載內(nèi)容負(fù)責(zé)。
- 6. 下載文件中如有侵權(quán)或不適當(dāng)內(nèi)容,請與我們聯(lián)系,我們立即糾正。
- 7. 本站不保證下載資源的準(zhǔn)確性、安全性和完整性, 同時也不承擔(dān)用戶因使用這些下載資源對自己和他人造成任何形式的傷害或損失。
最新文檔
- 豬圓環(huán)病毒衣殼蛋白的表達(dá)及其單克隆抗體的制備.pdf
- 豬圓環(huán)病毒2型ORF2基因的原核表達(dá)及其單克隆抗體的制備和鑒定.pdf
- Ⅱ型豬圓環(huán)病毒ORF2、ORF3基因的克隆表達(dá)與潛在應(yīng)用研究.pdf
- 鴨肝炎病毒單克隆抗體的制備及初步應(yīng)用.pdf
- 鴨圓環(huán)病毒ORF3基因的序列分析及基因表達(dá).pdf
- 鴨肝炎病毒的純化及其單克隆抗體的制備與鑒定.pdf
- 抗豬圓環(huán)病毒Ⅱ型單克隆抗體的制備及應(yīng)用.pdf
- I型鴨肝炎病毒單克隆抗體的制備.pdf
- 人CystatinC基因克隆、表達(dá)研究及其單克隆抗體和多克隆抗體的制備.pdf
- 水牛IFN-γ克隆表達(dá)及其單克隆抗體的制備與應(yīng)用.pdf
- 豬瘟病毒單克隆抗體的制備及其應(yīng)用.pdf
- 豬圓環(huán)病毒2型的分離及其單克隆抗體的制備.pdf
- 人IL-17基因克隆、表達(dá)及其單克隆抗體的制備.pdf
- 犬瘟熱病毒單克隆抗體的制備及其應(yīng)用.pdf
- 抗豬圓環(huán)病毒Ⅱ型ORF2蛋白單克隆抗體的制備鑒定及Ⅰ型ORF2基因的研究.pdf
- 豬圓環(huán)病毒2型ORF2基因在昆蟲桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)的表達(dá)及單克隆抗體的研制及其初步應(yīng)用.pdf
- 抗hTNF-α單克隆抗體的制備及其抗體基因克隆研究.pdf
- 鴨腸炎病毒糖蛋白B單克隆抗體的制備與鑒定.pdf
- 豬圓環(huán)病毒2型Cap蛋白單克隆抗體的制備與鑒定.pdf
- 豬圓環(huán)病毒Ⅱ型Cap蛋白單克隆抗體的制備和鑒定.pdf
評論
0/150
提交評論