人CYP2E1野生型及CYP2E1-2、CYP2E1-3和CYP2E1-4突變體重組酶的表達(dá)及其代謝活性研究.pdf

1、本課題通過(guò)使用桿狀病毒-昆蟲(chóng)表達(dá)系統(tǒng)異源表達(dá)了人CYP2E1野生型蛋白及CYP2E1*2、CYP2E1*3和CYP2E1*4三個(gè)有氨基酸變化的突變體蛋白。 為藥物Ⅰ相代謝的研究提供了單一性的酶源，同時(shí)也將CYP2E1野生型蛋白與突變體之間的代謝動(dòng)力學(xué)參數(shù)進(jìn)行對(duì)比。 目的： 表達(dá)CYP2E1野生型蛋白及CYP2E1*2、CYP2E1*3和CYP2E1*4三個(gè)突變體蛋白，比較它們之間的代謝動(dòng)力學(xué)差異，同時(shí)為藥物Ⅰ相代

2、謝的研究提供單一性的酶源。 方法： 以人肝組織RNA為模板進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增反應(yīng)，獲得CYP2E1基因的cDNA序列，然后通過(guò)定點(diǎn)突變獲得三個(gè)突變體的cDNA序列。將這些基因分別連接至pGEM-T載體上并進(jìn)行DNA測(cè)序，選取正確序列的CYP2E1野生型及三個(gè)突變型基因，與pFastBac質(zhì)粒連接，得到的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入大腸桿菌DH10Bac感受態(tài)細(xì)胞中，經(jīng)過(guò)轉(zhuǎn)座作用，產(chǎn)生重組粘粒DNA(Bacmid-CYP2E1s)。該

3、重組粘粒轉(zhuǎn)染Sf9細(xì)胞后，即產(chǎn)生重組桿狀病毒。 將構(gòu)建好的CYP2E1病毒，與本實(shí)驗(yàn)室已構(gòu)建好的CYPOR、CYPb5病毒一起加入Sf9細(xì)胞中共表達(dá)這三種蛋白以獲得有代謝活性的重組酶。通過(guò)測(cè)定共表達(dá)方法中三種病毒間不同的比例、不同的細(xì)胞感染復(fù)數(shù)值，以及不同的表達(dá)時(shí)間等條件下的活性，選取最佳表達(dá)條件。 以氯唑沙宗和7-甲氧基-4-三氟甲基香豆素作為底物，分別檢測(cè)重組酶的活性，并比較CYP2E1野生型與突變體之間的代謝動(dòng)力學(xué)

4、參數(shù)。 結(jié)果: 對(duì)構(gòu)建各CYP2E1s重組病毒的每個(gè)步驟的鑒定，表明本實(shí)驗(yàn)成功構(gòu)建了含有正確目的基因序列的各重組CYP2E1s病毒。將各重組CYP2E1s病毒分別感染Sf9細(xì)胞，通過(guò)RT-PCR實(shí)驗(yàn)表明目的基因在mRNA水平上有表達(dá)； 通過(guò)westernblot實(shí)驗(yàn)表明目的蛋白在蛋白水平有表達(dá)。 以氯唑沙宗和7-甲氧基-4-三氟甲基香豆素為底物，分別對(duì)重組酶的代謝活性進(jìn)行檢測(cè)，表明構(gòu)建的CYP2E1野生型

5、及CYP2E1*2、CYP2E1*3和CYP2E1*4突變體重組酶都有代謝活性，它們對(duì)氯唑沙宗的代謝動(dòng)力學(xué)參數(shù)Km分別為72.4、40.83、37.16和32.66μmol·L-1，Vmax分別為0.402、0.374、0.356和0.354μmol·min-1·g-1protein；對(duì)7-甲氧基-4-三氟甲基香豆素的代謝動(dòng)力學(xué)參數(shù)Km分別為35.3、10.6、19.2和14.22μmol·L-1，Vmax分別為0.023、0.034、