CYP2E1酶在去甲斑蝥素代謝和環(huán)孢素誘導(dǎo)肝損傷中的作用研究.pdf

1、細(xì)胞色素P450酶2E1亞型（CYP2E1酶）可介導(dǎo)多種體內(nèi)、外源性化合物代謝，在藥理學(xué)和毒理學(xué)研究方面作用十分重要，本研究以去甲斑蝥素和環(huán)孢素為切入點(diǎn)，分別對CYP2E1酶在藥物代謝和藥物性肝損傷發(fā)病過程中的作用進(jìn)行探討。
　　去甲斑蝥素用于腫瘤治療多年，但其體內(nèi)代謝過程尚未完全清楚。本研究首先采用MetaPrint2D軟件，根據(jù)去甲斑蝥素及其水解產(chǎn)物去甲斑蝥酸化學(xué)結(jié)構(gòu)中原子指紋特征，基于數(shù)據(jù)挖掘和統(tǒng)計分析技術(shù)，通過計算原子作為

2、代謝位點(diǎn)的發(fā)生率，預(yù)測去甲斑蝥素及其代謝物去甲斑蝥酸代謝位點(diǎn)及可能代謝產(chǎn)物;采用Sybyl軟件分別進(jìn)行CYP1A2，CYP2A6，CYP2B6，CYP3A4，CYP2D6，CYP2C9，CYP2E1和CYP2C19酶與去甲斑蝥酸對接;然后選擇其中得分較高者，進(jìn)行人重組CYP450酶體外代謝實驗，結(jié)果顯示，CYP2E1、CYP2C19和CYP2C9酶均參與介導(dǎo)去甲斑蝥酸代謝過程。人重組CYP2E1酶介導(dǎo)去甲斑蝥素體外代謝呈米氏動力學(xué)過程，

3、Km為23.64μM，CL為0.689ml/mmolCYP2E1/min;最后對體內(nèi)外代謝產(chǎn)物進(jìn)行分離鑒定，結(jié)果證實，去甲斑蝥素進(jìn)入體內(nèi)后，首先水解為去甲斑蝥酸，進(jìn)而發(fā)生氧橋水解、六元環(huán)不同方式斷裂開環(huán)或脫羧，進(jìn)一步發(fā)生氧化代謝，轉(zhuǎn)化為小分子化合物排出體外，或與葡萄糖醛酸、甘氨酸、谷胱甘肽等發(fā)生結(jié)合反應(yīng)，增加水溶性，利用消除，軟件預(yù)測與體內(nèi)、體外代謝實驗結(jié)果基本一致。
　　CYP2E1酶活性區(qū)域小，有利于小分子化合物進(jìn)入，但分子內(nèi)

4、作用力和分子間范德華力能量較高，易導(dǎo)致酶-藥物復(fù)合物不穩(wěn)定;CYP2E1酶介導(dǎo)內(nèi)外源性化合物代謝時發(fā)生變構(gòu)，易導(dǎo)致氧化應(yīng)激，誘導(dǎo)肝損傷發(fā)生。環(huán)孢素誘導(dǎo)肝損傷發(fā)病率約為30％，但其機(jī)制尚不清楚。本研究對322名長期服用環(huán)孢素進(jìn)行抗排異或免疫抑制相關(guān)治療的患者全血樣本進(jìn)行了CYP2E1基因型檢測，首先對200名患者進(jìn)行13種SNPs檢測，經(jīng)Hardy-Weinberg平衡檢驗和遺傳連鎖分析，從中選擇6個標(biāo)簽SNPs，其余患者僅進(jìn)行標(biāo)簽SNP

5、測定，采用病例-對照研究方法，對全部患者6種標(biāo)簽SNPs與環(huán)孢素誘導(dǎo)肝損傷進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，結(jié)果顯示，患者服用環(huán)孢素后，環(huán)孢素血清谷濃度與肝損傷發(fā)生未呈現(xiàn)明顯相關(guān)性;rs3813866(-1563T＞A)為環(huán)孢素誘導(dǎo)肝損傷易感基因(OR:2.325,95％CI:1.491-3.626)。
　　進(jìn)一步從細(xì)胞分子水平，采用點(diǎn)突變技術(shù)，構(gòu)建rs3813866突變體質(zhì)粒載體，轉(zhuǎn)染至HepG-2細(xì)胞，探索易感SNP如何調(diào)控CYP2E1蛋白表達(dá)或

6、酶活性，結(jié)果顯示，rs381366突變可使CYP2E1啟動子活性增強(qiáng)約2.46倍，mRNA水平上調(diào)約1.64倍，導(dǎo)致攜帶rs381366突變基因的患者服用環(huán)孢素后，易發(fā)生誘導(dǎo)肝損傷;環(huán)孢素可使CYP2E1啟動子活性增強(qiáng)，上調(diào)啟動子活性能力與藥物濃度成正比，但環(huán)孢素對CYP2E1啟動子活性的上調(diào)作用遠(yuǎn)小于rs381366突變的影響;環(huán)孢素對細(xì)胞中CYP2E1mRNA表達(dá)水平的影響與啟動子活性相反，環(huán)孢素干預(yù)后，野生型和突變型CYP2E1m