大鼠ACE基因打靶載體的構(gòu)建及ACE敲入細(xì)胞模型的制備.pdf

1、目的：克隆大鼠血管緊張素轉(zhuǎn)化酶Ⅰ(Angiotensin I Converting Enzyme,ACE)cD-NA,構(gòu)建pEGFP-ACE真核表達(dá)載體,并在HepG2細(xì)胞中表達(dá),為獲得穩(wěn)定表達(dá)大鼠ACE的細(xì)胞模型做準(zhǔn)備,為ACEI類降壓藥物的篩選提供基礎(chǔ)。
　　 方法：①pEGFP-ACE基因打靶載體的構(gòu)建及鑒定:提取大鼠肺臟組織總RNA,利用RT-PCR得到 ACE cD-NA。回收純化PCR產(chǎn)物并與載體質(zhì)粒pEGFP-C1

2、同時進(jìn)行SalI和Acc65I雙酶切,經(jīng)T4DNA連接酶作用后,轉(zhuǎn)化至感受態(tài)E.coli DH5α,在含有卡那霉素(30μg/mL)的LB瓊脂平板上培養(yǎng)過夜,挑取克隆并酶切篩選。陽性克隆進(jìn)行測序,用BLAST軟件與Gene-Bank數(shù)據(jù)庫進(jìn)行同源性分析。②HepG2細(xì)胞的轉(zhuǎn)染和重組大鼠ACE蛋白的表達(dá)及檢測:提取重組質(zhì)粒pEGFP-ACE,在250V,20ms的情況下電轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞。在轉(zhuǎn)染48h后收集細(xì)胞,Western blot

3、鑒定重組ACE蛋白的表達(dá)情況。
　　 結(jié)果：①利用RT-PCR成功獲得大鼠ACE cDNA,構(gòu)建pEGFP-ACE重組真核表達(dá)載體,挑取克隆,經(jīng)EcoRI酶切鑒定、測序及BLAST分析,得到重組質(zhì)粒。②電轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞48h后,Westernblot鑒定轉(zhuǎn)染pEGFP-ACE質(zhì)粒的HepG2細(xì)胞中約180KD處出現(xiàn)條帶。
　　 結(jié)論：成功構(gòu)建大鼠肺臟ACE基因的真核表達(dá)載體pEGFP-ACE,并提示可能在HepG2細(xì)