重組大鼠腎上腺髓質(zhì)素基因?qū)趋兰∪毖俟嘧p傷保護(hù)作用研究.pdf

1、目的：采用真核表達(dá)載體pVAX1，構(gòu)建重組大鼠腎上腺髓質(zhì)素(rrADM)，直接注射法導(dǎo)入大鼠腓腸肌，通過構(gòu)建大鼠骨骼肌缺血再灌注模型，探討rrADM對(duì)骨骼肌缺血再灌注損傷是否具有保護(hù)作用。并比較rrADM、依達(dá)拉豐、維拉帕米、別嘌呤醇和罌粟堿在骨骼肌缺血再灌注損傷中保護(hù)作用的差異。
　　 方法：
　　 1.SD大鼠1只，取大鼠腎上腺提取總RNA，用RT-PCR方法逆轉(zhuǎn)錄合成ADM基因的cDNA，以cDNA為模板擴(kuò)增，將產(chǎn)

2、物克隆至PMD-18T載體上，亞克隆至pVAX1真核表達(dá)載體上，獲得rrADM質(zhì)粒DNA，采用堿性裂解法大量提取質(zhì)粒DNA，采用聚乙二醇分級(jí)沉淀法純化質(zhì)粒DNA。計(jì)算所獲質(zhì)粒DNA濃度。
　　 2.SD大鼠18只，體重(203±18.4)g，按體重完全隨機(jī)分為3組，每組6只。即正常對(duì)照組、空載體組、700μg·kgbw-1rrADM組。3組分別注射生理鹽水1ml、pVAX1質(zhì)粒DNA生理鹽水溶液1ml、rrADM質(zhì)粒DNA生理鹽

3、水溶液1ml，采用直接肌注法導(dǎo)入大鼠左后肢腓腸肌，質(zhì)粒DNA注射劑量均為700μg·kgbw-1，每周一次，連續(xù)4周。4周后取注射部位肌肉，免疫組織化學(xué)法檢測各組ADM的表達(dá)情況。
　　 3.SD大鼠64只，體重(203±18.4)g，按體重完全隨機(jī)分為8組，每組8只。即正常對(duì)照(C)組、缺血再灌注模型(IR)組、空載體(Ev)組、rrADM組、依達(dá)拉豐(Ed)組、維拉帕米(Vp)組、別嘌呤醇(Ap)組、罌粟堿(Pp)組。術(shù)前4

4、周，Ev組、rrADM組分別腓腸肌注射pVAX1質(zhì)粒DNA生理鹽水溶液1ml、rrADM質(zhì)粒DNA生理鹽水溶液1ml，其它6組，分別腓腸肌注射等量的生理鹽水。每周一次，連續(xù)4周，4周后用于骨骼肌缺血再灌注實(shí)驗(yàn)，缺血4小時(shí)，再灌注3小時(shí)。再灌注前15分鐘，Ed組、Vp組、Ap組、Pp組分別腹腔注射Ed0.5mg/kg鹽水溶液1ml、Vp2mg/kg鹽水溶液1ml、AP50mg/kg鹽水溶液1ml、Pp5mg/kg鹽水溶液1ml；其它4組分

5、別腹腔注射等量的生理鹽水。術(shù)畢，取大鼠腓腸肌組織并收集血清，檢測血清肌酸激酶(CK)、乳酸脫氫酶(LDH)含量，檢測肌組織丙二醛(MDA)、總超氧化物歧化酶(T-SOD)含量，并對(duì)肌組織進(jìn)行病理形態(tài)學(xué)檢查。
　　 結(jié)果：
　　 1.所獲基因序列與Genebank中的ADM基因序列比較，兩者完全一致。對(duì)rrADM XbaI和HindⅢ雙酶切鑒定結(jié)果為陽性。純化后的質(zhì)粒DNA：OD260值為0.912，OD280值為0.49

6、8，OD260/OD280比值為1.831。所獲質(zhì)粒DNA濃度為4.560mg/ml。
　　 2.注射部位的腓腸肌組織免疫組織化學(xué)檢測顯示：正常對(duì)照組、空載體組腓腸肌組織ADM表達(dá)水平低下，結(jié)果呈陰性；700μg·kgbw-1 rrADM組腓腸肌組織ADM表達(dá)水平高，結(jié)果呈陽性。
　　 3.與IR組大鼠血漿CK、LDH及肌組織MDA含量比較，rrADM組、Ed組、Vp組、Ap組、Pp組水平均明顯降低(P＜0.01)；與I

7、R組大鼠肌組織T-SOD含量比較，rrADM組、Ed組、Vp組、Ap組、Pp組水平均明顯升高(P＜0.01)。IR組與Ev組之間各指標(biāo)差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。rrADM組、Ed組、Vp組、Ap組、Pp組，5組與Ev組相比各指標(biāo)差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。rrADM組、Ed組、Vp組、Ap組、Pp組5組間各指標(biāo)，除大鼠血漿LDH含量rrADM組與Ap組相比下降了18.20％(P＜0.05)，其余各組間各指標(biāo)差異均無統(tǒng)計(jì)

8、學(xué)意義(P＞0.05)。病理學(xué)檢查表明，IR組與Ev組注射部位骨骼肌鏡下可見大面積肌組織結(jié)構(gòu)紊亂，邊界模糊不清，炎性細(xì)胞聚集、滲出較多，組織水腫嚴(yán)重。而rrADM組、Ed組、Vp組、Ap組、Pp組5組鏡下偶見輕微的肌絲斷裂或組織水腫，少量或未見炎性細(xì)胞聚集，肌組織結(jié)構(gòu)正常，病理學(xué)改變明顯好于IR組與Ev組。
　　 結(jié)論：
　　 1.成功獲得大鼠ADM基因，并成功的重組了大鼠腎上腺髓質(zhì)素，大量提取和純化的rrADM質(zhì)粒DN

9、A，符合動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的用藥要求。
　　 2.rrADM質(zhì)粒DNA注射入大鼠腓腸肌后，使組織中ADM表達(dá)上調(diào)。表明質(zhì)粒構(gòu)建是成功的，質(zhì)粒的導(dǎo)入和組織攝取情況較好，可用于下一階段的實(shí)驗(yàn)。
　　 3.rrADM能提高大鼠骨骼肌組織T-SOD活性，降低肌組織MDA含量和血漿CK、LDH含量，對(duì)大鼠骨骼肌缺血再灌注損傷有保護(hù)作用。依達(dá)拉豐、維拉帕米、別嘌呤醇和罌粟堿對(duì)大鼠骨骼肌缺血再灌注損傷有保護(hù)作用，且rrADM、依達(dá)拉豐、維拉帕米