膜聯(lián)蛋白A3與絨癌細(xì)胞耐藥相關(guān)性的初步研究.pdf

1、研究背景及目的:
　　 目前在滋養(yǎng)細(xì)胞腫瘤的治療中，耐藥是最棘手的問(wèn)題。腫瘤細(xì)胞形成耐藥的機(jī)制極其復(fù)雜，滋養(yǎng)細(xì)胞腫瘤的耐藥機(jī)制也至今為止尚未明確。在本課題組前期的工作中，成功建立了采用間斷和連續(xù)兩種不同的誘導(dǎo)方法誘導(dǎo)的五種臨床滋養(yǎng)細(xì)胞腫瘤化療常用藥物（FUDR/5-Fu/MTX/KSM/VP-16）的絨毛膜上皮癌JeG-3細(xì)胞耐藥細(xì)胞株。JeG-3親本敏感株與FUDR耐藥株的基因芯片結(jié)果，提示ANXA3基因在兩株細(xì)胞間存在明顯差

2、異，鑒于在多種腫瘤中Annexin A3蛋白均被證實(shí)與腫瘤的預(yù)后、耐藥相關(guān)，且查閱文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)目前沒(méi)有Annexin A3在滋養(yǎng)細(xì)胞腫瘤中研究的報(bào)道，因此我們?cè)噲D初步探討該蛋白在滋養(yǎng)細(xì)胞腫瘤的表達(dá)情況，并且進(jìn)一步證實(shí)其是否在絨癌JeG-3細(xì)胞株及各耐藥細(xì)胞株間存在表達(dá)差異。體外細(xì)胞培養(yǎng)是研究耐藥機(jī)制的很好的平臺(tái)與基礎(chǔ)，但腫瘤細(xì)胞在活體的耐藥機(jī)制可能更為復(fù)雜;而且由于滋養(yǎng)細(xì)胞腫瘤有可依靠化療治愈的特殊性，初始的未經(jīng)過(guò)化療的絨癌臨床病理標(biāo)本取得

3、很困難，因此要觀察活體內(nèi)蛋白表達(dá)情況并且驗(yàn)證JeG-3親本細(xì)胞株與JeG-3/FUDR耐藥細(xì)胞株在活體內(nèi)的耐藥性是否與體外培養(yǎng)相符，都需要依靠動(dòng)物模型。本研究動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的目的為建立絨癌細(xì)胞株移植瘤動(dòng)物模型，測(cè)定絨癌JeG-3/FUDR耐藥細(xì)胞株活體移植瘤的耐藥性，并觀察Annexin A3在活體瘤內(nèi)表達(dá)情況。
　　 研究方法:
　　 1.使用細(xì)胞計(jì)數(shù)法檢測(cè)各個(gè)耐藥細(xì)胞株在停藥18個(gè)月后的耐藥指數(shù)(RI)以評(píng)定耐藥性，并以高

4、濃度繼續(xù)間斷誘導(dǎo)耐藥株，在停藥6月后檢測(cè)耐藥性的變化。
　　 2.用Western Blot法驗(yàn)證Annexin A3蛋白在敏感株及耐藥株間的表達(dá)差異。
　　 3.用熒光定量PCR法驗(yàn)證mRNA水平ANXA3基因在敏感株及耐藥株間的表達(dá)差異。并在基因表達(dá)較敏感株升高的JeG-3/FUDR耐藥株、JeG-3/MTX耐藥株中檢測(cè)間斷耐藥至各濃度梯度時(shí)ANXA3基因的變化。
　　 4.建立裸鼠絨癌移植瘤模型，分別以Je

5、G-3敏感株及JeG-3/FUDR耐藥株皮下接種成瘤，摸索FUDR藥物作用的合適劑量，并檢測(cè)活體移植瘤的耐藥性。
　　 5.觀察絨癌成瘤的組織學(xué)形態(tài)、裸鼠模型血清β HCG水平，用免疫組織化學(xué)法測(cè)定Annexin A3蛋白在活體瘤組織中的表達(dá)情況。
　　 研究結(jié)果:
　　 1.停藥18個(gè)月后大部分耐藥細(xì)胞株的耐藥性降低不明顯，耐藥性仍穩(wěn)定。在原耐藥株基礎(chǔ)上，繼續(xù)加入高濃度化療藥間斷誘導(dǎo)的細(xì)胞株，在停藥半年檢測(cè)耐藥

6、性，發(fā)現(xiàn)RI有降低趨勢(shì)。
　　 2.經(jīng)Western Blot驗(yàn)證，JeG-3/FUDR耐藥株、JeG-3/MTX耐藥株細(xì)胞中Annexin A3蛋白表達(dá)明顯高于敏感株，而JeG-3/KSM耐藥株及JeG-3/VP16耐藥株與親本細(xì)胞株未顯示出差異。
　　 3.經(jīng)熒光定量PCR驗(yàn)證，JeG-3/FUDR耐藥株、JeG-3/MTX耐藥株ANXA3基因在mRNA水平較親本JeG-3細(xì)胞顯著升高。JeG-3/VP16耐藥株AN

7、XA3基因較親本細(xì)胞株表達(dá)下降，但差異無(wú)顯著性。通過(guò)熒光定量PCR驗(yàn)證的結(jié)果與基因芯片結(jié)果一致。
　　 4.建立絨癌JeG-3敏感株及JeG-3/FUDR耐藥株細(xì)胞裸鼠皮下移植瘤模型，摸索出合適的FUDR腹腔注射劑量為62.5ug/g鼠重;在活體內(nèi)，F(xiàn)UDR對(duì)二者所成皮下瘤體的抑瘤率無(wú)明顯差異。
　　 5.免疫組化結(jié)果顯示Annexin A3在絨癌瘤組織中有表達(dá)，呈胞漿及胞膜表達(dá)。鏡下見(jiàn)在FUDR耐藥株成瘤中的表達(dá)強(qiáng)于敏

8、感株成瘤，與細(xì)胞水平的研究結(jié)果相符。
　　 結(jié)論:
　　 1.前期構(gòu)建的絨癌耐藥細(xì)胞株耐藥性穩(wěn)定，但繼續(xù)給予大劑量沖擊式誘導(dǎo)可造成細(xì)胞耐藥性的下降，大劑量沖擊式誘導(dǎo)法不適合作為絨癌耐藥細(xì)胞株的誘導(dǎo)方法。
　　 2.Annexin A3在絨癌細(xì)胞株中表達(dá)，JeG-3/FUDR、JeG-3/MTX耐藥細(xì)胞株與敏感細(xì)胞株相比該蛋白表達(dá)升高，在mRNA水平ANXA3基因水平變化也呈現(xiàn)相同的趨勢(shì)，提示該蛋白的表達(dá)可能與FU