Prohibitin蛋白與卵巢癌紫杉醇耐藥相關(guān)性的初步研究.pdf

1、目的:
　　 用RNA干擾技術(shù)沉默卵巢癌紫杉醇耐藥株中表達(dá)上調(diào)的Prohibitin(PHB)基因，通過MTT和流式細(xì)胞術(shù)分析沉默目的基因后靶細(xì)胞（卵巢癌紫杉醇耐藥細(xì)胞系SKOV3/Taxol-25）的細(xì)胞增殖與凋亡情況，闡明PHB為卵巢癌紫杉醇耐藥相關(guān)蛋白，為逆轉(zhuǎn)卵巢癌紫杉醇耐藥提供理論和實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
　　 方法:
　　 1.在前期研究基礎(chǔ)上（采用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)比較卵巢癌紫杉醇耐藥細(xì)胞系（SKOV3/Taxol-

2、25）和敏感細(xì)胞系(SKOV3)的蛋白質(zhì)表達(dá)的差異，發(fā)現(xiàn)PHB蛋白在SKOV3/Taxol-25中表達(dá)明顯上調(diào)，提示PHB高表達(dá)可能與卵巢癌紫杉醇耐藥有關(guān)），采用Westernblot及RealTime-PCR方法驗(yàn)證SKOV3/Taxol-25細(xì)胞株及SKOV3細(xì)胞株中PHB蛋白與mRNA的表達(dá)差異。
　　 2.應(yīng)用RNA干擾技術(shù)沉默PHB基因:以脂質(zhì)體Lipofectamine2000為載體，將針對(duì)靶基因PHB設(shè)計(jì)的帶有熒光

3、蛋白的三個(gè)特異性小發(fā)夾RNA干擾片段pshRNA/PHB427（實(shí)驗(yàn)組PHB1）、pshRNA/PHB248（實(shí)驗(yàn)組PHB2）、pshRNA/PHB136(實(shí)驗(yàn)組PHB3)及pshRNA/NC（空載質(zhì)粒）瞬時(shí)轉(zhuǎn)染于卵巢癌紫杉醇耐藥細(xì)胞株(SKOV3/Taxol-25)。
　　 3.在熒光顯微鏡下定時(shí)觀察細(xì)胞熒光表達(dá)情況，在轉(zhuǎn)染48小時(shí)后，采用Westernblot及RealTime-PCR檢測(cè)PHB蛋白與mRNA水平的表達(dá)情況以

4、了解沉默效果，并篩選出沉默效果較明顯的兩個(gè)片段分別為實(shí)驗(yàn)組，與陰性對(duì)照組進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)比較。
　　 4.通過MTT實(shí)驗(yàn)檢測(cè)兩組細(xì)胞的增殖能力、流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞的凋亡情況。
　　 結(jié)果:
　　 1.PHB蛋白與mRNA在SKOV3/Taxol-25及SKOV3細(xì)胞株中差異表達(dá):Western-blot結(jié)果顯示PHB蛋白在SKOV3/Taxol-25細(xì)胞株中表達(dá)高于SKOV3細(xì)胞株，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.05);

5、RealTime-PCR結(jié)果顯示PHBmRNA在SKOV3/Taxol-25細(xì)胞株中的表達(dá)高于SKOV3細(xì)胞株，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.05)。
　　 2.成功干擾各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞中PHB的表達(dá):通過瞬時(shí)轉(zhuǎn)染靶向pshRNA/PHB質(zhì)粒于SKOV3/Taxol-25細(xì)胞株，轉(zhuǎn)染后可見SKOV3/Taxol-25細(xì)胞株有綠色熒光表達(dá)，提示轉(zhuǎn)染成功，在熒光顯微鏡下觀察到轉(zhuǎn)染48h后的靶細(xì)胞綠色熒光表達(dá)最強(qiáng);Western-blot結(jié)果

6、顯示三組片段均能抑制PHB蛋白的表達(dá)，其中干擾48小時(shí)后的沉默效應(yīng)最佳，以片段pshRNA/PHB427（實(shí)驗(yàn)組PHB1）、pshRNA/PHB136(實(shí)驗(yàn)組PHB3)干擾效果更好，兩實(shí)驗(yàn)組蛋白相對(duì)表達(dá)量分別為(0.652±0.224)％、(0.598±0.026)％，與陰性對(duì)照組(pshRNA/NC)的(0.84±0.039)％相比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.05)，而pshRNA/PHB427（實(shí)驗(yàn)組PHB1）、pshRNA/PH

7、B248（實(shí)驗(yàn)組PHB2）及pshRNA/PHB136(實(shí)驗(yàn)組PHB3)各實(shí)驗(yàn)組之間進(jìn)行兩兩比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＞0.05)，選擇干擾效應(yīng)較好的片段pshRNA/PHB427（實(shí)驗(yàn)組PHB1）及pshRNA/PHB136(實(shí)驗(yàn)組PHB3)進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn);RealTime-PCR結(jié)果顯示:將片段pshRNA/PHB4.27（實(shí)驗(yàn)組PHB1）、pshRNA/PHB136(實(shí)驗(yàn)組PHB3)分別轉(zhuǎn)染目的細(xì)胞干擾48h后，實(shí)驗(yàn)組PHB1（ps

8、hRNA/PHB427）、實(shí)驗(yàn)組PHB3(pshRNA/PHB136)與陰性對(duì)照組(pshRNA/NC)的（2-ΔΔCt）之間進(jìn)行比較，各實(shí)驗(yàn)組的PHBmRNA相對(duì)表達(dá)量較陰性對(duì)照組有明顯下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.05)，而實(shí)驗(yàn)組PHB1(pshRNA/PHB427)與實(shí)驗(yàn)組PHB3(pshRNA/PHB136)之間進(jìn)行比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＞0.05)。
　　 3.PHB對(duì)細(xì)胞增殖及凋亡能力的影響:分別在干擾后0h、

9、24h、48h、72h及96h后進(jìn)行MTT法檢測(cè)SKOV3/Taxol-25細(xì)胞株的增殖能力變化，結(jié)果顯示實(shí)驗(yàn)組PHB1（pshRNA/PHB427）及實(shí)驗(yàn)組PHB3(pshRNA/PHB136)的細(xì)胞增殖明顯減慢，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.05);流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，在RNA干擾沉默SKOV3/Taxol-25細(xì)胞株中PHB基因后，各實(shí)驗(yàn)組的凋亡細(xì)胞明顯增加，同陰性對(duì)照組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.05)，實(shí)驗(yàn)組PHB1(pshRNA

10、/PHB427)與實(shí)驗(yàn)組PHB3(pshRNA/PHB136)之間的凋亡率進(jìn)行比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＞0.05)。
　　 結(jié)論:
　　 針對(duì)PHB合成的shRNA能夠有效地抑制卵巢癌紫杉醇耐藥細(xì)胞株（SKOVS/Taxol-25）中PHB基因在蛋白和mRNA水平的表達(dá)，沉默后的SKOVS/Taxol-25細(xì)胞株的細(xì)胞增殖能力下降、細(xì)胞凋亡增加，提示PHB與卵巢癌紫杉醇耐藥產(chǎn)生相關(guān);干擾PHB的表達(dá)可能降低卵巢癌紫杉醇