C類凝集素16家族中的成員A(CLEC16A)與自身免疫性疾病之間關(guān)系的研究.pdf

1、免疫系統(tǒng)的活化,最根本的事件是免疫細(xì)胞識別病原體(抗原或者病原體模式分子)之后,誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)的信號傳導(dǎo),激活免疫細(xì)胞的特異功能。Toll樣受體(Toll-like receptors,TLRs)是介導(dǎo)這一過程的一類重要模式識別受體,如TLR4能識別細(xì)菌來源的LPS,從而激活抗原遞呈細(xì)胞包括樹突狀細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和B細(xì)胞。和其它免疫反應(yīng)一樣,TLR介導(dǎo)的信號傳導(dǎo)和細(xì)胞激活過程受到多個層面的調(diào)節(jié),以保證不會因為其活化過度而損傷到宿主自身。很多類

2、似調(diào)節(jié)是一種負(fù)反饋調(diào)節(jié),即TLR能誘導(dǎo)一些調(diào)節(jié)因子的表達(dá),這些調(diào)節(jié)因子反過來能抑制TLR信號,所以許多具有調(diào)節(jié)作用的分子都是TLR信號的靶基因。從尋找TLR4信號激活誘導(dǎo)的基因著手,研究參與TLR4信號傳導(dǎo)和調(diào)節(jié)的基因。利用了生物信息學(xué)分析尋找到一些基因表達(dá)受到TLR4信號特異激活的分子,并進(jìn)一步分析它們的生物學(xué)功能。CLEC16A是我們從LPS激活的小鼠脾臟細(xì)胞中篩選出來的一個基因,它的表達(dá)在受到LPS刺激后顯著增加,預(yù)示著它可能在T

3、LR信號傳遞和樹突狀細(xì)胞的活化和生物學(xué)功能起到調(diào)節(jié)作用。暫時還沒有文獻(xiàn)報道對CLECl6A基因功能學(xué)的研究,本課題組采用一些初步的實驗方法,來研究CLEC16A蛋白在細(xì)胞內(nèi)的定位以及它與其他未知蛋白的相互作用。
　　 方法:PCR擴(kuò)增CLEC16A截短后片段及全長,利用限制性內(nèi)切酶SalⅠ和NotⅠ將其連接至載體pGEX-4T-3,將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌,挑取單菌落,提取質(zhì)粒,經(jīng)PCR和雙酶切鑒定后測序。將轉(zhuǎn)化正確的大腸桿菌過夜

4、培養(yǎng),IPTG誘導(dǎo)融合蛋白表達(dá),利用GST pull down實驗固定谷胱甘肽珠子,釣取目的蛋白,之后將釣取到的目的蛋白酶解后送去做質(zhì)譜分析。根據(jù)文獻(xiàn)得知,在果蠅中CLEC16A的同源基因EMA,與Vps16,Vps18,Vps33a之間存在相互作用,采用Co-IP的方法來驗證CLEC16A與它們之間是否也存在相互作用。免疫熒光實驗檢測CLEC16A在HEK293細(xì)胞內(nèi)的定位。結(jié)果:CLEC16A基因的截短片段及全長成功連接至載體pGE