C型凝集素樣受體Dectin-1與CLEC-2的相關(guān)研究.pdf

1、第一部分hDectin-1E的亞細(xì)胞定位及與RanBPM相互作用的研究
　　 C型凝集素樣受體Dectin-1是一個(gè)Ⅱ型跨膜的細(xì)胞表面受體,與自然殺傷細(xì)胞表面的C型凝集素樣受體具有高度的同源性。Dectin-1作為β-1,3/β-1,6-葡聚糖的受體,能夠介導(dǎo)β-葡聚糖的識(shí)別和內(nèi)化。Dectin-1主要表達(dá)在樹(shù)突細(xì)胞,巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞等細(xì)胞表面,在一些非專業(yè)的抗原遞呈細(xì)胞表面也有表達(dá),如HEK293T細(xì)胞。Dectin-1含

2、有胞漿尾部,跨膜區(qū)以及胞外段三部分,其中胞外段含有單個(gè)的C型凝集素樣結(jié)構(gòu)域(CTLD)和一個(gè)頸部區(qū),胞漿尾部含有免疫受體酪氨酸活化基序(ITAM)。Dectin-1由于其未成熟的pre-mRNA的選擇性剪接,產(chǎn)生多個(gè)異構(gòu)體。人的Dectin-1有兩種主要的(A和B)和六種次要的(C-H)異構(gòu)體。異構(gòu)體A和B是β-葡聚糖的主要受體,而后六種異構(gòu)體的功能尚不明確。在這六種異構(gòu)體中,異構(gòu)體E(hDectin-1E)結(jié)構(gòu)非常特殊,其N(xiāo)末端含有I

3、TAM基序,C末端為完整的C型凝集素樣結(jié)構(gòu)域。與異構(gòu)體A(hDectin-1A)相比,它缺少了部分胞漿區(qū),跨膜區(qū)和頸部區(qū),但是目前對(duì)其生物學(xué)功能尚未研究。
　　 由于跨膜區(qū)的缺失,可能導(dǎo)致hDectin-1E與全長(zhǎng)的Dectin-1有著不一樣的亞細(xì)胞定位。我們首先通過(guò)免疫熒光和免疫印跡等實(shí)驗(yàn)方法,證實(shí)了hDectin-1E不能被分泌到細(xì)胞外,也不能定位到細(xì)胞表面,而主要定位于細(xì)胞胞漿中。為了進(jìn)一步研究hDectin-1E的功能,

4、以hDectin-1E的完整的C型凝集素樣結(jié)構(gòu)域作為誘餌,利用Gal4酵母雙雜交系統(tǒng)篩選人的胸腺cDNA文庫(kù)。經(jīng)過(guò)三輪營(yíng)養(yǎng)缺陷篩選,我們鑒定了一個(gè)構(gòu)架蛋白R(shí)anBPM作為hDectin-1E的一個(gè)相互作用蛋白。通過(guò)體外結(jié)合實(shí)驗(yàn)我們證實(shí)了它們的相互作用,并且表明RanBPM的SPRY結(jié)構(gòu)域在與hDectin-1E相互作用中是必須的。在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中我們通過(guò)免疫共沉淀進(jìn)一步證實(shí)了hDectin-1E與RanBPM的相互作用,免疫熒光共聚焦分析也

5、揭示了它們?cè)诩?xì)胞中存在共定位。RanBPM作為一個(gè)構(gòu)架蛋白,具有介導(dǎo)蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)的相互作用,整合信號(hào)傳導(dǎo)通路等功能。RanBPM招募胞漿中的hDectin-1E,可能有助于hDectin-1EN末端的ITAM基序的活化以及其介導(dǎo)的細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo),但具體的生物學(xué)功能還有待進(jìn)一步研究。
　　 第二部分Hsp60作為Dectin-1潛在的配體及其激活巨噬細(xì)胞成熟機(jī)制的研究
　　 Dectin-1作為β-葡聚糖的受體,能夠介導(dǎo)β

6、-葡聚糖的內(nèi)化和其誘導(dǎo)的生物學(xué)效應(yīng)。Β-葡聚糖是許多真菌細(xì)胞壁的主要成分,因此,Dectin-1能夠識(shí)別真菌細(xì)胞壁中的酵母聚糖并在機(jī)體抵御真菌感染的過(guò)程中發(fā)揮著重要作用。當(dāng)Dectin-1結(jié)合其配體后,導(dǎo)致其胞漿尾部的ITAM樣基序被Src磷酸化,從而招募Syk酪氨酸激酶,激活下游信號(hào)傳導(dǎo),誘導(dǎo)活性氧的產(chǎn)生和呼吸爆發(fā),殺滅病原微生物,介導(dǎo)TNF-α等細(xì)胞因子的分泌從而進(jìn)一步調(diào)節(jié)機(jī)體的免疫。除了能夠識(shí)別β-葡聚糖之外,Dectin-1還能

7、識(shí)別T細(xì)胞表面的內(nèi)源性配體,促進(jìn)T細(xì)胞的增殖,并且這種識(shí)別不能被酵母聚糖所抑制。此外,研究表明Dectin-1也能夠結(jié)合HEK293細(xì)胞表面的尚未鑒定的配體,當(dāng)細(xì)胞凋亡時(shí)這種結(jié)合能力增加,表明Dectin-1所識(shí)別的配體在細(xì)胞凋亡時(shí)表面表達(dá)水平增加。但是,Dectin-1所識(shí)別的內(nèi)源性配體還有待進(jìn)一步鑒定。
　　 我們?cè)诶媒湍鸽p雜交分析,在人胸腺cDNA文庫(kù)中篩選與Dectin-1的C型凝集素樣結(jié)構(gòu)域相互作用的蛋白。我們篩選到

8、一個(gè)血漿中可溶性蛋白Hsp60。在哺乳動(dòng)物中,Hsp60作為一個(gè)伴侶分子定位在細(xì)胞線粒體中,參與了線粒體內(nèi)蛋白質(zhì)折疊。在外界環(huán)境的壓力下,包括感染,應(yīng)激等,Hsp60可以易位到胞漿,細(xì)胞膜,還可以分泌到細(xì)胞外,能夠調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)的功能。Hsp60被抗原遞呈細(xì)胞內(nèi)化,促進(jìn)抗原遞呈細(xì)胞的成熟和細(xì)胞因子的分泌。然而,介導(dǎo)Hsp60內(nèi)化的受體目前還尚未鑒定。因此,我們推測(cè)Dectin-1可能作為Hsp60的受體。在我們的實(shí)驗(yàn)中,我們證實(shí)了Dect

9、in-1作為Hsp60的受體,能夠結(jié)合并內(nèi)化Hsp60。通過(guò)表面能量共振分析表明它們的結(jié)合解離常數(shù)為1.04e-6M。我們也表明了Hsp60能夠快速激活Syk酪氨酸激酶,通過(guò)使用Syk抑制劑抑制Syk活性表明Syk位于MAPK信號(hào)通路的上游。此外,Hsp60以Syk酪氨酸激酶依賴的方式促進(jìn)巨噬細(xì)胞成熟和誘導(dǎo)促炎癥因子的分泌。因此,Dectin-1作為Hsp60的受體,將為以Hsp60作為治療藥物的研究提供基礎(chǔ)和新的思路。
　　

10、第三部分鼠CLEC-2異構(gòu)體的鑒定及分子屬性研究
　　 CLEC-2是通過(guò)使用含有免疫學(xué)功能的C型凝集素結(jié)構(gòu)域篩選基因組數(shù)據(jù)庫(kù)組時(shí)被鑒定的。人的CLEC-2(hCLEC-2)是一個(gè)Ⅱ型跨膜的C型凝集素樣受體,其中胞外段含有單個(gè)的C型凝集素樣結(jié)構(gòu)域和一個(gè)頸部區(qū),胞漿尾部含有D-x-Y-x-x-L基序。最近研究表明,hCLEC-2能夠識(shí)別外源性配體蛇毒Khodocytin和內(nèi)源性配體Podoplanin,導(dǎo)致Y-x-x-L基序磷酸化

11、,招募Syk酪氨酸激酶從而激活血小板。另外,它還能夠協(xié)同DC-SIGN促進(jìn)血小板捕獲HW-1。鼠的CLEC-2(mCLEC-2)與hCLEC-2具有高度的同源性,缺失Ca2+依賴性糖基結(jié)合位點(diǎn)和含有D-x-Y-x-x-L基序,目前對(duì)其研究較少。
　　 在我們克隆mCLEC-2的過(guò)程中,除了已經(jīng)報(bào)到的全長(zhǎng)形式外,我們克隆了2個(gè)尚未報(bào)道的選擇性剪切異構(gòu)體(mCLEC-2B,mCLEC-2C)。通過(guò)NorthernBlot分析我們進(jìn)一

12、步表明了我們鑒定的異構(gòu)體在組織中的存在。這兩個(gè)新的異構(gòu)體己提交到Genebank(EF070191和EF070192)。與全長(zhǎng)相比,mCLEC-2B缺少跨膜區(qū),有一個(gè)594bp的開(kāi)放性讀框;mCLEC-2C缺少跨膜區(qū)和部分CTLD從而導(dǎo)致了mCLEC-2C的mRNA編碼序列預(yù)先終止而只有252bp的開(kāi)放性讀框。通過(guò)RT-PCR反應(yīng)我們檢測(cè)了mCLEC-2三個(gè)異構(gòu)體在不同組織以及細(xì)胞系中的表達(dá)情況,兩個(gè)新的異構(gòu)體與全長(zhǎng)的mCLEC-2有著

13、不一樣的組織分布和細(xì)胞表達(dá)。進(jìn)一步也研究表明,mCLEC-2B和mCLEC-2C都不能被分泌到細(xì)胞外,也不能定位到細(xì)胞膜表面,而主要定位于細(xì)胞漿中。進(jìn)一步的研究也表明,細(xì)胞膜表面的mCLEC-2能被細(xì)胞表面的蛋白酶剪切并釋放到培液中,形成可溶形式的CLEC-2(sCLEC-2),并且這種剪切能被aprotinin和PMSF蛋白酶抑制劑所抑制,表明這種剪切可能是由aprotinin和PMSF敏感的蛋白酶所剪切的。此外,在mCLEC-2的頸