塞來昔布影響大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞增殖、成骨分化.pdf

1、背景與目的：非甾體類抗炎藥(NSAIDs)在臨床上廣泛用于骨關(guān)節(jié)損傷及骨性關(guān)節(jié)炎的抗炎及止痛治療。但發(fā)現(xiàn)傳統(tǒng)的NSAIDs以及選擇性環(huán)氧化酶-2(COX-2)抑制劑對(duì)骨折愈合存在一定的負(fù)面效應(yīng)。目前有關(guān)于選擇性COX-2抑制劑對(duì)于骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)的增殖及分化效應(yīng)的直接影響及其具體作用機(jī)制仍不明確。本實(shí)驗(yàn)?zāi)康氖峭ㄟ^觀察不同濃度的塞來昔布對(duì)rBMSCs的增殖、成骨誘導(dǎo)分化及ALP mRNA、OCN mRNA表達(dá)等影響，并探討塞

2、來昔布影響rBMSCs成骨誘導(dǎo)分化的可能機(jī)制。
　　方法：采用大鼠全骨髓貼壁法分離并體外培養(yǎng)、擴(kuò)增及鑒定獲得rBMSCs;通過細(xì)胞計(jì)數(shù)法獲知細(xì)胞倍增時(shí)間;使用不同濃度的塞來昔布(0、12.5、25、50、100umol/l)分別干預(yù)培養(yǎng)rBMSCs24以及48小時(shí)，MTS法檢測不同濃度的塞來昔布對(duì)rBMSCs增殖的影響;采用較高濃度的塞來昔布(100umol/l)加成骨誘導(dǎo)液（10-5M地塞米松、10mMβ-甘油磷酸、50ug/m

3、l抗壞血酸）誘導(dǎo)rBMSCs成骨分化，分別在誘導(dǎo)的第3天、7天以及14天進(jìn)行ALP染色、茜素紅染色，并提取總RNA，應(yīng)用Realtime PCR擴(kuò)增ALP、OCN以及β-actin。
　　結(jié)果：根據(jù)茜素紅染色以及流式細(xì)胞表面抗原測定結(jié)果表明我們成功分離、獲得了rBMSCs;根據(jù)細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果，經(jīng)統(tǒng)計(jì)獲得細(xì)胞倍增時(shí)間約為26小時(shí)。藥物干預(yù)24小時(shí)以及48小時(shí)，細(xì)胞增殖抑制實(shí)驗(yàn)表明100umol/L塞來昔布對(duì)rBMSCs增殖抑制明顯，具

4、有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);12.5、25以及50umol/L塞來昔布對(duì)rBMSCs增殖抑制無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。ALP染色結(jié)果表明成骨誘導(dǎo)3天對(duì)照組以及實(shí)驗(yàn)組ALP表達(dá)活性均較微弱，染色均為陰性;誘導(dǎo)7天對(duì)照組ALP活性逐漸上升，染色為陽性，而實(shí)驗(yàn)組染色始終為陰性;誘導(dǎo)14天對(duì)照組ALP活性進(jìn)一步升高，染色為陽性，實(shí)驗(yàn)組可見細(xì)胞大量脫落壞死，染色陰性。茜素紅染色結(jié)果表明:成骨誘導(dǎo)3天對(duì)照組以及實(shí)驗(yàn)組染色均為陰性;誘導(dǎo)7天對(duì)照

5、組及實(shí)驗(yàn)組染色仍為陰性;誘導(dǎo)至14天對(duì)照組可見明顯鈣結(jié)節(jié)形成，染色陽性，而此時(shí)實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞壞死明顯，未見鈣結(jié)節(jié)形成，染色呈陰性。熒光定量PCR結(jié)果表明:成骨誘導(dǎo)3天對(duì)照組以及實(shí)驗(yàn)組ALP mRNA、OCN mRNA表達(dá)均較低;成骨誘導(dǎo)7天對(duì)照組ALP mRNA表達(dá)明顯升高并維持在較高水平，實(shí)驗(yàn)組ALPmRNA表達(dá)升高趨勢較弱，對(duì)照組OCN mRNA表達(dá)與第3天相比基本無差異，實(shí)驗(yàn)組OCN mRNA表達(dá)下降明顯;誘導(dǎo)14天對(duì)照組ALP mR

6、NA表達(dá)出現(xiàn)明顯下降，實(shí)驗(yàn)組ALP mRNA表達(dá)與第7天相比無明顯差異，對(duì)照組OCN mRNA表達(dá)進(jìn)一步達(dá)到較高水平，實(shí)驗(yàn)組OCN mRNA表達(dá)與第7天相比基本無變化。
　　結(jié)論：本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn):
　　1.高濃度的塞來昔布(100umol/L)對(duì)rBMSCs增殖具有顯著抑制效應(yīng);較低濃度的塞來昔布(12.5、25以及50umol/l)對(duì)rBMSCs增殖抑制無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　2.高濃度的塞來昔布(100umol/L)能夠抑