羽扇豆醇對(duì)肝癌細(xì)胞的抑制作用及其機(jī)制研究.pdf

1、目的:研究三萜類(lèi)化合物羽扇豆醇對(duì)肝癌細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用和凋亡誘導(dǎo)效應(yīng)，并探討羽扇豆醇抗肝癌效應(yīng)的作用機(jī)制。 方法:1.用RT-PCR和Western Blot法檢測(cè)DR3在肝癌細(xì)胞HepG2，SMMC7721以及肝正常細(xì)胞株Chang 1ivet的表達(dá)。2.不同濃度的羽扇豆醇(1-200μmol/L)作用于肝癌細(xì)胞株HepG2，SMMC7721以及肝正常細(xì)胞株Chang liver48小時(shí)，用MTT法測(cè)定羽扇豆醇對(duì)肝癌細(xì)胞的生長(zhǎng)

2、抑制作用。選用0，15，25和35μmol/L的羽扇豆醇進(jìn)行進(jìn)一步的研究。不同濃度的羽扇豆醇作用于SMMC7721細(xì)胞48小時(shí)之后：Hoechst33258染色后熒光顯微鏡下觀察有無(wú)細(xì)胞凋亡，流式細(xì)胞儀法檢測(cè)凋亡和確定凋亡率；Western Blot法檢測(cè)Caspase3，Caspase9蛋白的表達(dá)變化：用Caspase8阻斷劑觀察對(duì)羽扇豆醇誘導(dǎo)凋亡的阻斷效應(yīng)。3.為了探討羽扇豆醇的作用機(jī)制，用RT-PCR法檢測(cè)DR3、Fas、DR5等

3、死亡受體及死亡相關(guān)受體相關(guān)蛋白FADD，TRADD mRNA的表達(dá)：Western Blot法同時(shí)對(duì)DR3和Fas的蛋白表達(dá)進(jìn)一步分析研究。此外，用Western Blot法檢測(cè)Bcl-2，Bax，p53和NF-κB/p65等蛋白的表達(dá)變化；用RT-PCR法檢測(cè)p53和NF-κB/p65 mRNA的表達(dá)。4.用DR3單克隆抗體預(yù)處理肝癌細(xì)胞1小時(shí)后，觀察DR3單克隆抗體與DR3交聯(lián)后對(duì)肝癌細(xì)胞生長(zhǎng)和凋亡有無(wú)影響，觀察對(duì)羽扇豆醇的細(xì)胞凋亡

4、誘導(dǎo)作用有無(wú)影響。 結(jié)果:1.在蛋白水平和mRNA水平，肝癌細(xì)胞株DR3的表達(dá)明顯高于正常肝細(xì)胞。2.羽扇豆醇對(duì)肝癌細(xì)胞具有生長(zhǎng)抑制和誘導(dǎo)凋亡的作用。 (1)MTT試驗(yàn)證實(shí)羽扇豆醇對(duì)肝癌細(xì)胞的增殖抑制效應(yīng)具有濃度依賴(lài)關(guān)系。羽扇豆醇作用48小時(shí)后，與對(duì)照組相比，各濃度組的細(xì)胞活力有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義上的顯著差別(P<0.05)。不同濃度組之間的細(xì)胞活力也有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義上顯著差別(P<0.05)。(2)0，15，25，35μmol/L的羽扇豆

5、醇作用48小時(shí)后，SMMC7721細(xì)胞經(jīng)Hochest33258法染色，在熒光顯微鏡下可以觀察到凋亡現(xiàn)象：細(xì)胞體積縮小，染色質(zhì)濃縮，并見(jiàn)核碎裂，凋亡小體出現(xiàn)。 (3)通過(guò)流式細(xì)胞技術(shù)顯示，不同濃度的羽扇豆醇作用48小時(shí)后，肝癌細(xì)胞SMMC7721發(fā)生了凋亡，凋亡率分別為0.3％，8.1％，15.7％和33％。 (4)Western Blot檢測(cè)證實(shí)，0，15，25，35μmol/L的羽扇豆醇作用于SMMC7721細(xì)胞48h后，Caspa

6、se3酶原表達(dá)水平下降，活性形式增加。3.對(duì)死亡受體及其相關(guān)蛋白的表達(dá)影響。(1)RT-PCR檢測(cè)證實(shí)，羽扇豆醇作用于肝癌細(xì)胞后：DR3mRNA表達(dá)受到抑制，F(xiàn)asmRNA表達(dá)未檢測(cè)到。(2)Western Blot檢測(cè)證實(shí)，DR3表達(dá)受到抑制，并且與濃度成依賴(lài)關(guān)系。Fas表達(dá)在SMMC7721細(xì)胞缺失，經(jīng)羽扇豆醇處理也不能誘導(dǎo)表達(dá)。 (3)死亡受體相關(guān)蛋白FADDmRNA表達(dá)增加。TRADDmRNA無(wú)明顯變化。(4)Caspase8阻

7、斷劑能夠部分阻斷羽扇豆醇的效應(yīng)：減弱羽扇豆醇誘導(dǎo)的生長(zhǎng)抑制、凋亡和Caspase3的表達(dá)。(5)DR3單克隆抗體預(yù)處理不能誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞SMMC7721發(fā)生凋亡，然而預(yù)處理能夠部分拮抗羽扇豆醇誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡和Caspase3酶的激活。4.對(duì)線粒體通路相關(guān)分子和基因的影響。(1)Western Blot檢測(cè)證實(shí)，0，15，25，35μmol/L羽扇豆醇作用48h后，Caspase9表達(dá)增加；線粒體凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2表達(dá)下降，Bax表達(dá)沒(méi)

8、有明顯變化。p53表達(dá)增加，NF-kB/p65表達(dá)下降。 (2)RT-PCR檢測(cè)證實(shí)， Bcl-2 mRNA表達(dá)下降，未檢測(cè)到BaxmRNA表達(dá)。p53 mRNA表達(dá)增加，然而NF-kBmRNA表達(dá)受到抑制。 結(jié)論: 1.羽扇豆醇對(duì)肝癌細(xì)胞具有生長(zhǎng)抑制和凋亡誘導(dǎo)作用。 2.抑制DR3的表達(dá)是其主要機(jī)制之一，DR3可能是羽扇豆醇抗肝癌作用的一個(gè)重要靶標(biāo)分子。3.羽扇豆醇可能還通過(guò)抑制NF-K B表達(dá)和增強(qiáng)P53表達(dá)，下調(diào)Bcl-2