蛇床子素(osthole)對肝細胞肝癌的抑制作用及其機制研究.pdf

1、第一章蛇床子素抗肝細胞肝癌作用的研究
　　目的：研究蛇床子素抗肝癌作用及其特點。
　　方法：采用MTT方法和流式細胞術觀察蛇床子素對體外培養(yǎng)肝癌細胞株增殖、凋亡和周期的影響；應用SMMC-7721裸鼠肝癌模型和Hepa1-6 C57小鼠肝癌模型觀察蛇床子素在體的抗肝癌效應和毒性，及其在肝癌小鼠體內的吸收和分布研究。
　　結果：
　　1）蛇床子素對人肝癌細胞SK-HEP-1、SMMC-7721和HepG-2，小鼠肝

2、癌細胞Hepa1-6的增殖均有抑制作用，且有劑量和時間依賴關系；也可抑制正常肝細胞的增殖，但其IC50高于四株肝癌細胞，表現(xiàn)為其細胞毒性是有選擇性的。
　　2）蛇床子素可誘導人肝癌細胞SMMC-7721和小鼠肝癌細胞Hepa1-6的凋亡，對周期進程阻滯在G2期。
　　3）蛇床子素可抑制裸鼠和C57小鼠肝癌模型的腫瘤生長，腹腔注射給藥方式優(yōu)于口服灌胃。
　　4）蛇床子素可以進入肝癌小鼠血流較豐富的組織（包括腫瘤），其轉運

3、機制主要為簡單的被動擴散。
　　結論：蛇床子素是一種低毒、具有抗肝癌效應的天然化合物。
　　第二章蛇床子素誘導肝細胞肝癌凋亡機制的研究
　　目的：闡明蛇床子素誘導肝癌細胞凋亡的機制。
　　方法：應用Real-time PCR方法觀察蛇床子素對凋亡相關84個基因表達的影響；采用western blot和EMSA技術觀察蛇床子素對Bax、Bcl-2、Caspase、PARP、CyclinB、NF-κB蛋白水平以及PI

4、3K/Akt通路調節(jié)的影響；并采用MTT法觀察蛇床子素與Trail聯(lián)合用藥對SMMC-7721肝癌細胞增殖的影響。
　　結果：
　　1）蛇床子素可以使28個凋亡相關因子表達升高，其中TNF受體（占21.43%）和TNF配體（占17.86%）家族所占比例最高。
　　2）蛇床子素可以上調肝癌細胞中Bax蛋白的表達，下調Bcl-2蛋白的表達，使Bax/Bcl-2的比值增高；促進Caspase-3、Caspase-8和Casp

5、ase-9的活化，PARP蛋白酶的剪切；下調周期蛋白Cyclin B1的表達。
　　3）蛇床子素可抑制肝癌細胞中NF-κB的活化，有時間和劑量依賴性。
　　4）蛇床子素對肝癌細胞中總Akt表達無影響，可下調磷酸化Akt和PI3K二個亞基（p110和p85）蛋白的表達。胰島素可以減弱蛇床子素對磷酸化Akt和PI3K p110亞基蛋白表達的下調，而LY294002可增強其下調作用。
　　5）蛇床子素可增強TRAIL對SMM

6、C-7721肝癌細胞增殖的抑制，但隨著蛇床子素濃度的增加，其增強作用逐漸減弱。
　　結論：蛇床子素誘導凋亡的機制是多靶點和多通路；可能作用于與TRAIL相同的靶點，其機制為通過抑制PI3K/Akt通路的激活，從而抑制NF-κB的活化，下調周期蛋白CyclinB，阻滯細胞在G2/M期；同時可以上調Bax蛋白表達，激活Caspase-9；并通過死亡結構受體激活Caspase-8，繼而激活Caspase-3，促進PARP的剪切，從而誘導

7、肝癌細胞凋亡。
　　第三章蛇床子素對抗腫瘤免疫功能的增強效應
　　目的：研究蛇床子素對肝癌小鼠免疫系統(tǒng)的影響，進一步從免疫增強角度探討蛇床子素抗肝癌的作用機制。
　　方法：采用MTT法觀察蛇床子素對體外培養(yǎng)脾淋巴細胞增殖的影響；應用Hepa1-6 C57小鼠肝癌模型，采用流式細胞術測定小鼠脾臟中各淋巴細胞亞群和ELISA法測定血清中IL-2、TNF-α水平，觀察蛇床子素對小鼠抗肝癌免疫反應的影響。
　　結果：

8、r>　　1）低濃度的蛇床子素可以促進未刺激和ConA、LPS刺激下小鼠脾淋巴細胞的增殖。
　　2）蛇床子素對肝癌小鼠的胸腺重量和胸腺指數(shù)無影響，對脾臟重量和脾臟指數(shù)有增高趨勢。
　　3）蛇床子素對肝癌小鼠脾臟中B細胞的比例和數(shù)量，及其活化和成熟均無影響；有升高巨噬細胞、CD4+T和CD8+T細胞的比例和數(shù)量的趨勢，對CD4+/CD8+比值保持在正常水平，并可提高腫瘤組織中CD4+T和CD8+T細胞的比例。
　　4）蛇床