食管癌組織中ZIP5基因的表達(dá)以及穩(wěn)定低表達(dá)ZIP5基因食管癌細(xì)胞系的構(gòu)建.pdf

1、目的:
　　1研究在食管癌組織、癌旁組織、正常組織中ZIP5基因的表達(dá)情況，探索ZIP5基因在食管癌發(fā)展中可能的作用。
　　2構(gòu)建ZIP5基因穩(wěn)定低表達(dá)的食管癌細(xì)胞系，為后續(xù)細(xì)胞水平實(shí)驗(yàn)和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)提供理論和實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。全面研究ZIP5基因在食管癌發(fā)生發(fā)展中的作用及機(jī)制，為食管癌的預(yù)防及靶向治療提供新的理論基礎(chǔ)。
　　方法:
　　1從食管癌患者手術(shù)切除部分取食管癌組織、癌旁組織、正常組織各30例，利用免疫組化實(shí)驗(yàn)比較

2、ZIP5蛋白在食管癌組織、癌旁組織與正常組織中的表達(dá)差異;用Western Blot實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證ZIP5蛋白在食管癌組織、癌旁組織和正常組織中的表達(dá)差異;用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法從mRNA水平驗(yàn)證ZIP5基因在食管癌組織、癌旁組織和正常組織中的表達(dá)差異。
　　2選擇有特異沉默ZIP5基因效果的siRNA序列，分子克隆攜帶特異序列的質(zhì)粒，將其克隆入慢病毒載體質(zhì)粒PSD31，包裝病毒，感染食管癌細(xì)胞系KYSE170，得到穩(wěn)定低表達(dá)ZIP5基

3、因的細(xì)胞系，并用實(shí)時(shí)熒光定量PCR和Western Blot來驗(yàn)證其沉默效果。
　　結(jié)果:
　　1免疫組化實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在30例食管癌組織中，有28例ZIP5基因表達(dá);在30例癌旁組織中，有13例ZIP5基因表達(dá);在30例正常組織中，有3例ZIP5基因表達(dá)，其表達(dá)量分別為4.10±0.51、0.78±0.97、0.20±0.03，ZIP5基因在組織中的表達(dá)水平從高到底依次是:癌組織，癌旁組織，正常組織。Western Blo

4、t實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，ZIP5蛋白在癌組織中相對(duì)表達(dá)量為3.05±0.20;在癌旁組織中相對(duì)表達(dá)量為1.78±0.92;正常組織中相對(duì)表達(dá)量為0.52±0.29，ZIP5基因在組織中的表達(dá)水平從高到底依次是:癌組織，癌旁組織，正常組織，與免疫組化結(jié)果相同;qRT-PCR結(jié)果顯示:以正常組織為標(biāo)準(zhǔn)，值為1，癌組織相對(duì)表達(dá)量為14.83±4.63，癌旁組織相對(duì)表達(dá)量為4.17±0.79，可認(rèn)為ZIP5基因在組織中的表達(dá)水平從高到低依次是:癌組織，

5、癌旁組織，正常組織，與以上結(jié)果相同。
　　2成功將攜帶特異序列的質(zhì)粒克隆入TA載體，通過酶切及測(cè)序驗(yàn)證重組質(zhì)粒的正確性;成功構(gòu)建PSD31-ZIP5-shRNA質(zhì)粒;成功包裝慢病毒并構(gòu)建穩(wěn)定細(xì)胞系;qRT-PCR及Western Blot檢測(cè)ZIP5蛋白表達(dá)下降，ZIP5基因穩(wěn)定低表達(dá)的食管癌細(xì)胞系成功建立。
　　結(jié)論:
　　1 ZIP5蛋白在食管癌組織、癌旁組織、正常組織中表達(dá)強(qiáng)度明顯由強(qiáng)到弱。
　　2 ZIP