HAAH基因的克隆表達及其在食管癌檢測中的研究.pdf

1、背景：近年來國內(nèi)外的多項研究報道人天冬氨酸鹽β羥化酶（HumanAspartyl/Asparaginyl β-Hydroxylase，HAAH）在多種類型癌癥組織及腫瘤細胞系中存在過表達現(xiàn)象，而在相應(yīng)的正常組織中卻不表達或低表達，這預(yù)示其較高的診斷價值。但在食管癌中該基因的研究還未見報導(dǎo)。本實驗檢測食管癌組織中該基因的表達情況，以初步評估其診斷價值。另一方面由于目前該蛋白的抗體仍未商品化，因此實驗利用原核表達系統(tǒng)表達該蛋白，為抗體的制備

2、及檢測工作打下基礎(chǔ)。
　　 方法：利用半定量RT-PCR 實驗方法，對23例手術(shù)切除的食管癌組織及23例癌旁組織樣本進行HAAH mRNA 表達水平的檢測，并對實驗結(jié)果進行統(tǒng)計學(xué)分析。
　　 根據(jù)GeneBank公開發(fā)表的HAAH cDNA 序列設(shè)計引物，用PCR 方法擴增開放閱讀框架內(nèi)642 bp的DNA 片段，并將該片段定向插入到原核表達載體pET-17b中，獲得重組表達質(zhì)粒。將PCR、酶切鑒定及測序鑒定正確的重組質(zhì)

3、粒，轉(zhuǎn)化入大腸桿菌E.coliRosetta(DE3)中，經(jīng)IPTG 誘導(dǎo)蛋白表達，SDS-PAGE 檢測分析。對重組蛋白的表達條件進行優(yōu)化，并對表達重組蛋白進行可溶性分析。在變性條件下利用Ni-NTA 凝膠親和層析純化重組蛋白。以重組蛋白作為抗原注射小鼠制備抗血清，利用Western blot 驗證重組蛋白的免疫原性。將純化的重組蛋白直接包被酶標板，利用間接ELISA的方法對16例食管癌病人及16例正常對照者血清中HAAH 自身抗體進

4、行檢測，進而對檢測方法的診斷價值進行評估。
　　 結(jié)果：HAAH mRNA在23例食管癌組織中均呈現(xiàn)表達，而在癌旁組織中有4例表達缺失，利用半定量分析其在癌組織和癌旁組織中的的表達水平值分別為0.690±0.236和0.306±0.159，癌癥組織顯著高于癌旁組織（P<0.01）。經(jīng)受試者特征(ROC)曲線分析，癌癥組織樣本中HAAH基因的高表達率73.9％（17/23），而在癌旁組織中僅為13.0％（3/23）。
　　

5、 獲得642 bp HAAH 編碼序列的DNA 片段，將該基因插入原核表達載體pET-17b中，成功構(gòu)建HAAH 重組蛋白表達系統(tǒng)pET-17b-HAAH/Rosetta(DE3)。SDS-PAGE 顯示該重組表達菌能高效表達出25 kDa 左右的融合蛋白，分子質(zhì)量大小與預(yù)期一致。通過改變IPTG的濃度，溫度和誘導(dǎo)時間，確定了表達基因的最佳誘導(dǎo)條件：IPTG 終濃度為0.4 mmo1/L，誘導(dǎo)時間為8 h，誘導(dǎo)溫度為27℃。經(jīng)定位分析，

6、目的蛋白以包涵體的形式存在。在變性條件下用Ni-NTA 凝膠親和層析法獲得了高純度的融合蛋白。利用免疫小鼠產(chǎn)生的抗血清，經(jīng)Western blot 驗證重組蛋白具有很好的免疫原性。間接ELISA法檢測16例食管癌病人和16例正常人血清中HAAH 自身抗體的OD450 值分別為0.168±0.042和0.107±0.033，食管癌病人組血清抗體水平明顯高于正常人，P<0.01。ROC曲線分析表明，當(dāng)選OD450=0.156 為cutoff