補(bǔ)腎填精方對(duì)兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞增殖與成骨分化影響的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：觀察補(bǔ)腎填精方含藥血清對(duì)兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs）增殖與成骨分化的影響。
　　方法：
　　1.分離出全骨髓，制成細(xì)胞懸液，貼壁培養(yǎng) BMSCs。通過(guò)成骨、成脂分化并病理染色及流式細(xì)胞檢測(cè)表面抗原的手段，來(lái)鑒定細(xì)胞，并建立穩(wěn)定的BMSCs體系。
　　2.制備補(bǔ)腎填精方含藥血清，并用含不同濃度（5﹪、10﹪、15﹪、20﹪、25﹪）的含藥血清

2、對(duì) BMSCs體外培養(yǎng)，其各組的相對(duì)增殖情況用MTT法檢測(cè)。
　　3.用含不同濃度（5﹪、10﹪、15﹪、20﹪、25﹪）含藥血清的培養(yǎng)液誘導(dǎo) BMSCs成骨分化，ALP活性檢測(cè)確定含藥血清干預(yù) BMSCs成骨分化的最佳濃度。
　　4.以上述血清濃度對(duì)實(shí)驗(yàn)Ⅰ組（含藥血清）、實(shí)驗(yàn)Ⅱ組（含藥血清+經(jīng)典成骨誘導(dǎo)液）、空白血清組、經(jīng)典成骨誘導(dǎo)組中的BMSCs進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)。采用 ALP檢測(cè)試劑盒檢測(cè)不同時(shí)間點(diǎn)（3d、7d、14d），各

3、組細(xì)胞中ALP活性。
　　5.ELISA法檢測(cè)不同時(shí)間點(diǎn)（7d、14d、21d），各組細(xì)胞分泌骨鈣素的含量。
　　6.各組細(xì)胞成骨誘導(dǎo)21 d后，茜素紅染色，低倍鏡下觀察各組鈣化結(jié)節(jié)并計(jì)數(shù)。
　　結(jié)果：
　　1.全骨髓篩選法分離培養(yǎng)出的BMSCs貼壁生長(zhǎng)，并且可被誘導(dǎo)分化為成骨細(xì)胞和脂肪細(xì)胞，低倍鏡下可見(jiàn)紅色脂滴，流式細(xì)胞儀檢測(cè)其表面抗原：CD34和CD44。
　　2.5％、15%的補(bǔ)腎填精方含藥血清組在經(jīng)

4、過(guò)24h培養(yǎng)后，與同濃度空白血清組細(xì)胞相對(duì)增殖情況相比，具有明顯的促進(jìn)作用（P﹤0.05），而48h后就只有15%的含藥血清組與同濃度空白血清組相比有促進(jìn)作用（P﹤0.05）。其它濃度的含藥血清組與同濃度空白血清組相比對(duì) BMSCs的增殖無(wú)明顯促進(jìn)作用（P﹥0.05）。
　　3.5%的含藥血清組對(duì) BMSCs干預(yù)誘導(dǎo)7d后,經(jīng)檢測(cè) ALP的活性最高，此為后續(xù)實(shí)驗(yàn)各組細(xì)胞培養(yǎng)的血清濃度。
　　4.在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)上實(shí)驗(yàn)Ⅰ組的ALP

5、活性明顯高于空白對(duì)照組（P<0.05）,而實(shí)驗(yàn)Ⅱ組的ALP活性則明顯高于經(jīng)典誘導(dǎo)組和實(shí)驗(yàn)Ⅰ組（P<0.05）。
　　5.對(duì) BMSCs干預(yù)誘導(dǎo)后，各組骨鈣素分泌量隨時(shí)間增長(zhǎng)而升高，且實(shí)驗(yàn)Ⅰ組的分泌量明顯高于空白組（P<0.05），實(shí)驗(yàn)Ⅱ組的骨鈣素分泌量則明顯高于經(jīng)典誘導(dǎo)組（P<0.05）。
　　6. BMSCs在成骨干預(yù)誘導(dǎo)21d后，空白對(duì)照組無(wú)鈣化結(jié)節(jié)形成，而其他各組均能在低倍鏡下觀察到鈣結(jié)節(jié)，且實(shí)驗(yàn)Ⅱ組的鈣化結(jié)節(jié)形成數(shù)量