HPV16 E2與IL-12聯(lián)合基因疫苗的免疫效果初步研究.pdf

1、目的：構(gòu)建人乳頭瘤病毒16型(HPV16)E2基因真核表達(dá)載體pcDNA3.1(+)/HPV16 E2，將其與IL-12真核表達(dá)載體pcDNA3.1(+)/IL-12聯(lián)合免疫BALB/c小鼠，檢測(cè)小鼠產(chǎn)生的特異性體液免疫和細(xì)胞免疫應(yīng)答水平，為HPV16誘發(fā)的宮頸癌治療性核酸疫苗的研制奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
　　方法：
　　(1)用PRIMER5.0軟件設(shè)計(jì)HPV16 E2基因引物，PCR擴(kuò)增HPV16 E2基因，經(jīng)EcoR I、Xh

2、o I或Not I雙酶切后連至載體 pcDNA3.1(+)或pGEX-6P-1，構(gòu)建真核細(xì)胞表達(dá)載體pcDNA3.1(+)/HPV16 E2和原核表達(dá)載體pGEX-6P-1/HPV16 E2，并進(jìn)行序列分析。
　　(2)將質(zhì)粒pcDNA3.1(+)/HPV16 E2轉(zhuǎn)染HeLa細(xì)胞，利用RT-PCR或Western-blot檢測(cè)HPV16 E2 mRNA或蛋白表達(dá)。將質(zhì)粒pGEX-6P-1/HPV16 E2轉(zhuǎn)化E.coli BL2

3、1，用IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，純化表達(dá)產(chǎn)物，Western-blot檢測(cè)GST-HPV16 E2純化產(chǎn)物。
　　(3)40只6W齡雌性BALB/c小鼠隨機(jī)分成PBS空白組、pcDNA3.1(+)空質(zhì)粒組、pcDNA3.1(+)/IL-12組、pcDNA3.1(+)/HPV16 E2單基因組以及 pcDNA3.1(+)/HPV16 E2＋pcDNA3.1(+)/IL-12聯(lián)合免疫組，每組8只。每只每次注射無(wú)菌PBS100?L或質(zhì)粒10

4、0?g于各組小鼠左后腿股四頭肌，免疫4次，1次/2W。于免疫前天剪尾取血以及第8W摘眼球放血，分離血清，-20℃保存；頸椎脫臼處死小鼠，剪取股四頭肌，制作組織切片；無(wú)菌取脾臟，制備脾細(xì)胞懸液。
　　(4)免疫熒光組化法檢測(cè)HPV16 E2蛋白在小鼠肌肉組織中的表達(dá)；ELISA間接法測(cè)定小鼠血清中HPV16 E2 IgG抗體水平以及脾細(xì)胞培養(yǎng)上清中IFN-γ、IL-4水平；MTT比色法檢測(cè)淋巴細(xì)胞的增殖，以刺激指數(shù)（SI）表示。

5、r>　　結(jié)果：
　　(1) DNA測(cè)序結(jié)果顯示1098bp HPV16 E2基因片段分別正確地連接入pcDNA3.1(+)與pGEX-6P-1載體。構(gòu)建的pcDNA3.1(+)/HPV16 E2真核表達(dá)載體能在HeLa細(xì)胞表達(dá)HPV16 E2 mRNA；表達(dá)的蛋白相應(yīng)的分子量約為42kDa；且在小鼠肌肉組織中也能有效表達(dá)HPV16 E2。構(gòu)建的pGEX-6P-1/HPV16 E2原核表達(dá)載體在E.coli BL21中表達(dá)分子量約6

6、8kDa的GST-HPV16 E2融合蛋白；Western-blot檢測(cè)該重組蛋白能與抗HPV16 E2抗體結(jié)合。
　　(2)小鼠免疫8w后，血清IgG抗體A450值HPV16 E2 DNA組（0.081±0.005）和聯(lián)合免疫組（0.084±0.005）顯著高于 PBS組（0.018±0.005）和 pcDNA3.1(+)組（0.019±0.009）（P<0.05）；但在每個(gè)時(shí)間點(diǎn)，聯(lián)合免疫組與單基因免疫組比較差異都沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意

7、義。
　　(3)小鼠脾淋巴細(xì)胞培養(yǎng)上清中的IFN-γ和 IL-4含量 pcDNA3.1(+)/IL-12組（83.98±6.07；36.51±2.68）、pcDNA3.1(+)/HPV16 E2組（94.55±5.87；68.40±6.13）和pcDNA3.1(+)/HPV16 E2+ pcDNA3.1(+)/IL-12組（116.32±5.15；70.08±6.10）明顯高于 PBS組（42.13±6.07；36.76±2.12

8、）和 pcDNA3.1(+)組（41.27±5.47；36.51±2.68），差異具有顯著性；聯(lián)合免疫組與單基因免疫組的IFN-γ含量差異也具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但兩組 IL-4含量差異沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　(4)脾淋巴細(xì)胞SI值pcDNA3.1(+)/IL-12組（1.25±0.12）、pcDNA3.1(+)/HPV16 E2組（1.43±0.08）和pcDNA3.1(+)/HPV16 E2+pcDNA3.1(+)/IL-12組（2.

9、01±0.07）明顯高于 PBS組（1.19±0.07）或 pcDNA3.1(+)組（1.16±0.16）（P<0.05）；且聯(lián)合免疫組高于單基因免疫組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)論：
　?。?）構(gòu)建的真核表達(dá)載體pcDNA3.1(+)/HPV16 E2能在HeLa細(xì)胞和小鼠，肌肉組織中表達(dá)HPV16E2蛋白。
　?。?）構(gòu)建的原核表達(dá)載體pGEX-6P-1/HPV16 E2能在E.coli BL21表達(dá)GST融合蛋白