新型苯并噻唑類衍生物抑制T細胞增殖的作用機制研究.pdf

1、T細胞增殖分化是免疫應(yīng)答的中心環(huán)節(jié)。但T細胞的異常增殖分化在移植排斥反應(yīng)以及類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎（rheumatoid arthritis，RA）、系統(tǒng)性紅斑狼瘡（systemic lupus erythematosus，SLE）、多發(fā)性硬化(multiple sclerosis，MS)、潰瘍性腸炎(ulcerative colitis，UC)與銀屑病(psoriasis，PsA)等自身免疫性疾病的發(fā)生發(fā)展過程中扮演著非常重要的角色。抑制T細

2、胞增殖分化與發(fā)揮生物學(xué)功能的免疫抑制劑革命性改變了這些疾病的臨床治療效果，使越來越多患者的病情能夠達到臨床緩解。
　　 但是，這些疾病均屬多因素誘發(fā)、多種細胞參與并涉及多條信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的復(fù)雜疾病。不同患者的誘發(fā)原因、發(fā)病機制以及對藥物的敏感性，存在顯著個體差異。治療過程中發(fā)現(xiàn)單一療法效果不明顯時，還需給予聯(lián)合、輪換或序貫治療。繼續(xù)探索疾病的發(fā)病機制，發(fā)現(xiàn)更多的治療靶點和全新結(jié)構(gòu)的先導(dǎo)化合物，將為患者提供更多的選擇與希望。

3、　　 本實驗室首先建立了檢測小鼠脾細胞與人外周血單個核細胞(peripheralblood mononuclear cells，PBMC)增殖的方法，從中藥、植物、微生物代謝產(chǎn)物及合成的化合物庫中篩選具有免疫抑制活性的新型小分子化合物。然后，在純化的T細胞中，探索篩選得到的新型小分子化合物的作用機制，包括細胞毒性、對IL-2產(chǎn)生與CD25表達的影響、對細胞周期的影響以及可能作用的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。最后，在T細胞介導(dǎo)的小鼠遲發(fā)型超敏反應(yīng)（d

4、elayed-typehypersensitivity reaction，DTH）模型中，證實它的體內(nèi)活性。本研究分3部分，茲分述如下。
　　 第1部分篩選具有免疫抑制活性的新型小分子化合物
　　 從中藥、植物、微生物代謝產(chǎn)物及合成的化合物庫中篩選具有免疫抑制活性的新型小分子化合物是本實驗室的研究方向之一。我們建立了使用流式細胞術(shù)在細胞水平進行免疫抑制活性高通量篩選的技術(shù)平臺。不僅從中藥、植物、微生物代謝產(chǎn)物中篩選具有免

5、疫抑制活性的新型天然小分子化合物，還通過化學(xué)合成，不斷積累新結(jié)構(gòu)的合成小分子化合物，期望從中發(fā)現(xiàn)新型免疫抑制劑。
　　 苯并噻唑類衍生物是一類芳香族雜環(huán)化合物，既往的研究主要集中于抗腫瘤、抗菌、抗驚厥以及抑制原卟啉原氧化酶等方面，但尚未發(fā)現(xiàn)有關(guān)免疫抑制活性的報道。我們合成了一組新型苯并噻唑類衍生物。免疫抑制活性篩選顯示，在這些新型苯并噻唑類衍生物中，BD711、BD713、BD750、BD751、BD753、BD755、BD75

6、6、BD757、BD759、BD760、BD761、BD763以及BD764可抑制ConA刺激的小鼠脾細胞與PHA刺激的人PBMC增殖。其中，BD750活性最高。但BD752、BD754、BD758、BD762、BD765、BD771、BD774、BD779以及BD782沒有抑制能力。因此，并非所有的苯并噻唑類衍生物都具有抑制活性，是否具有抑制活性以及活性的強弱與苯并噻唑類衍生物中的某些化學(xué)基團密切相關(guān)。
　　 本研究發(fā)現(xiàn)的這類

7、以BD750為代表的新型苯并噻唑類衍生物的結(jié)構(gòu)完全不同于目前臨床上使用的所有小分子免疫抑制劑，如環(huán)孢素A(ciclosporin A，CsA)、他克莫司(FK506)、雷帕霉素（rapamycin，RAPA）、麥考酚酸酯（mycophenolate mofetil，MMF）與霉酚酸鈉（mycophenolate sodium，MPS）等，也不同于尚處臨床試驗階段的激酶抑制劑，如Tofacitinib(CP-690，550)、ASP-01

8、5K與INCB018424等，按照結(jié)構(gòu)生物學(xué)的原理，結(jié)構(gòu)決定靶點與功能。BD750可能作用于已知的信號通路和靶細胞，但也可能作用于新的靶點。因此，觀察BD750的生物學(xué)效應(yīng)及其規(guī)律，不僅有助于探索其體內(nèi)外作用機制，作為評估未來臨床適應(yīng)證，發(fā)展為先導(dǎo)化合物的重要實驗依據(jù)。更重要的是，以BD750為探針將為探索T細胞介導(dǎo)的免疫疾病發(fā)病機制和治療策略，打開一扇新的窗口。
　　 第2部分苯并噻唑衍生物BD750抑制T細胞增殖的作用機制研

9、究
　　 作為先導(dǎo)化合物，新型苯并噻唑衍生物BD750已經(jīng)具有較高的活性。但要成為成熟的免疫抑制藥物，尋找或設(shè)計具有更高活性的BD750類似物是必經(jīng)之路。經(jīng)過結(jié)構(gòu)修飾后，BD750的衍生物可能具有更高抑制活性。這在免疫抑制劑的研究歷史中十分常見。目前進入Ⅲ期臨床的新型免疫抑制藥物CP690550源自對CP-352664的結(jié)構(gòu)修飾。CP-352664抑制合淋巴細胞反應(yīng)的IC50超過5μM。2010年FDA批準(zhǔn)的新型免疫抑制劑FTY

10、720，源自對冬蟲夏草培養(yǎng)液中鞘氨醇樣物質(zhì)ISP-1的結(jié)構(gòu)修飾，而最初發(fā)現(xiàn)ISP-1具有抑制人淋巴細胞增殖活性時，其IC50超過10μM。但是，倘若沒有找到BD750的作用靶分子，就無法進行基于靶分子的、有目的的藥物設(shè)計與改造，只能從已有或隨機合成的BD750類似物中尋找免疫抑制活性更強的化合物。因此，目前需解決的核心問題是明確BD750的作用機制。
　　 本研究采用羧基熒光素乙酰乙酸琥珀酰亞胺酯(5-carboxyfluore

11、sceindiacetate succinimide ester，CFSE)結(jié)合流式細胞術(shù)的經(jīng)典方法證實BD750抑制抗CD3/CD28 mAbs刺激的人T細胞增殖與混合淋巴細胞反應(yīng)，IC50分別為1.1±0.2μM與1.3±0.2μM。另外，BD750還可抑制抗CD3/CD28 mAbs、ConA、PMA/ionomycine刺激的小鼠T細胞增殖與PHA、PMA/ionomycine刺激的人T細胞增殖。
　　 雖然許多化合物也

12、能夠抑制T細胞增殖，但這種效應(yīng)并非是免疫抑制活性而是細胞毒性引起的。因此，在對BD750進行作用機制研究前，需要明確其抑制效應(yīng)是否來自細胞毒性。我們選擇了三種細胞，人靜息初始T細胞、IL-4處理的活化T細胞與成纖維樣滑膜細胞(fibroblast-like synoviocytes，F(xiàn)LS)，觀察BD750的細胞毒性。人靜息初始T細胞是一種不活化不增殖的T細胞。IL-4處理的活化T細胞是人初始T細胞先經(jīng)抗CD3/CD28 mAbs活化，

13、72小時后洗滌再加入IL-4維持細胞活力，但此時細胞處于不增殖狀態(tài)。FLS是一種非特異性增殖的細胞對照，取自需要進行關(guān)節(jié)置換手術(shù)的非關(guān)節(jié)炎患者，消化并培養(yǎng)、傳代。FLS能在體外傳10代，仍保持增殖能力。在我們的實驗條件下，BD750對人靜息初始T細胞（F=0.487，P=0.780，n=3）、IL-4處理的活化T細胞(F=0.717，P=0.623，n=3)與FLS(F=0.455，P=0.802，n=3)無顯著細胞毒性，提示BD750

14、選擇性抑制活化的T細胞增殖。
　　 IL-2、CD25與CD69等分子是T細胞活化的標(biāo)志。通過ELISA檢測細胞因子產(chǎn)生，流式細胞術(shù)檢測細胞膜分子表達，我們發(fā)現(xiàn)BD750不同于FK506，但與MPA、RAPA的效應(yīng)一致，不抑制活化的小鼠T細胞(F=0.387，P=0.765，n=3)與人T細胞（F=0.444，P=0.728，n=3）產(chǎn)生IL-2以及表達CD25與CD69，提示BD750不抑制T細胞活化。
　　 細胞周期

15、從G0/G1期進入S期是細胞增殖的前提和準(zhǔn)備。D-type cyclins（cyclin D1、cyelin D2與cyclin D3）與周期素依賴性蛋白激酶（CDK4與CDK6）具有調(diào)節(jié)細胞周期從G0/G1期進入S期的作用。通過PI染色結(jié)合流式細胞術(shù)檢測細胞周期變化以及WB檢測cyclin D3與CDK6表達，我們發(fā)現(xiàn)BD750抑制cyclin D3與CDK6的表達，并且顯著阻滯活化的小鼠T細胞周期(F=113.089，P=6.867

16、×10-7，n=3)與人T細胞周期（F=211.245，P=5.914×10-8，n=3）于G0/G1期。
　　 上述BD750抑制T細胞增殖的作用機制研究提示BD750作用的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)階段可能在T細胞活化后到細胞周期啟動前?；罨腡細胞分泌的IL-2與其受體CD25結(jié)合后，通過JAK3/STAT5信號通路與PI3K/AKT-mTOR/p70S6K信號通路啟動細胞周期進程與細胞增殖。為了探索BD750作用的信號通路，采用CFSE結(jié)

17、合流式細胞術(shù)與免疫印跡技術(shù)觀察BD750對IL-2誘導(dǎo)的CTLL-2細胞與活化的初始T細胞增殖以及STAT5、AKT與p70S6K表達與磷酸化的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn):BD750顯著抑制IL-2誘導(dǎo)的CTLL-2細胞與活化的人初始T細胞增殖;在IL-2誘導(dǎo)的活化T細胞中，BD750不抑制AKT磷酸化(F=0.317，P=0.813，n=3)以及p70S6K磷酸化（F=0.222，P=0.878，n=3），但顯著抑制STAT5磷酸化(F=104.

18、547，P=9.324×10-7，n=3);在IL-2誘導(dǎo)的CTLL-2細胞中，BD750也顯著抑制STAT5磷酸化（F=168.152，P=1.452×10-7，n=3）。這些發(fā)現(xiàn)提示，BD750通過阻斷IL-2誘導(dǎo)的JAK3/STAT5信號通路抑制T細胞增殖。
　　 T細胞在DTH的發(fā)病機制中占有非常重要的地位。為了明確BD750是否具有體內(nèi)活性，我們采用DNFB誘導(dǎo)BAL b/c小鼠發(fā)生DTH反應(yīng)的動物模型來觀察BD750

19、的作用。結(jié)果顯示，BD750顯著降低耳廓厚度(F=19.350，P=0.001，n=3)且顯著減輕耳廓重量(F=13.593，P=0.002，n=3)，提示BD750可緩解DTH誘發(fā)的耳廓水腫。
　　 JAK3/STAT5信號通路在T細胞增殖分化過程中占據(jù)非常重要的地位。JAK3或STAT5基因敲除的小鼠或基因缺陷的患者均表現(xiàn)出重度聯(lián)合免疫缺陷癥(Severe combined immunodeficiency，SCID)，充分

20、說明了JAK3/STAT5信號通路在免疫應(yīng)答過程中的重要作用。另外，JAK3僅表達于白細胞，而其它器官組織細胞中均不表達JAK3。以JAK3/STAT5信號通路為靶點的藥物，長期使用時將不會出現(xiàn)腎毒性、神經(jīng)毒性、高血脂和高血壓等副作用。BD750通過阻斷JAK3/STAT5信號通路完全抑制T細胞增殖。因此，BD750有望成為先導(dǎo)化合物研發(fā)用于器官移植與多種自身免疫性疾病的新型免疫抑制劑。
　　 第3部分水溶性苯并噻唑衍生物BD9

21、26的合成與作用機制研究
　　 在T細胞介導(dǎo)的小鼠DTH模型中，BD750的體內(nèi)活性不顯著且不穩(wěn)定，這將限制它的進一步研究與開發(fā)。推測主要原因是BD750難溶于水，在生理鹽水中的溶解性低于0.05mg/ml。水溶性差將極大限制藥物的應(yīng)用，比如吸收不完全或不穩(wěn)定，生物利用度低，起效慢，短時間內(nèi)達不到需要的血藥濃度。因此，進行結(jié)構(gòu)改造，合成水溶性衍生物，是了解該類化合物體內(nèi)生物學(xué)效應(yīng)的關(guān)鍵。
　　 常見的水溶性衍生物改造方法

22、包括:合成其丁二酸單酯、磷酸酯或硫酸酯等衍生物。但BD750特殊的烯醇互變結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致該羥基的酯類，特別是酸性酯難以生成，在合成過程中極易分解，難以獲得。即使合成了其羧基醚類水溶性衍生物，卻喪失了T細胞增殖抑制活性。另外一種常用的水溶性改造方法為合成其鈉鹽衍生物。經(jīng)過多次實驗，嘗試了氫氧化鈉水體系、DMF體系，均未成功。最后，在四氫呋喃體系下，獲得了一種水溶性衍生物BD926。BD926在生理鹽水中的溶解度超過15mg/ml，與BD750

23、相比水溶性提高了300倍。
　　 體外與體內(nèi)實驗均表明，BD926具有較強的免疫抑制活性且無顯著毒副作用。體外實驗發(fā)現(xiàn)，BD926顯著抑制小鼠與人T細胞增殖，且在完全抑制增殖的濃度下不影響人靜息初始T細胞（F=0.314，P=0.895，n=3）、IL-4處理的活化T細胞（F=0.342，P=0.878，n=3）與FLS（F=0.251，P=0.932，n=3）的存活，提示BD926選擇性抑制活化的T細胞增殖，抑制效應(yīng)不是細胞毒

24、性。不僅如此，BD926還表現(xiàn)出顯著的體內(nèi)免疫抑制效應(yīng)。在DNFB誘導(dǎo)小鼠發(fā)生DTH的模型中，BD926劑量超過5 mg/kg/d，即可顯著降低耳廓厚度(F=64.185，P=6.130×10-6，n=3)且顯著減輕耳廓重量（F=30.404，P=1.006×10-4，n=3），提示BD926可緩解DTH誘發(fā)的耳廓水腫。即使BD926的劑量超過200 mg/kg/d，也不會引起小鼠死亡、明顯飲食行為異常與疾病表現(xiàn)。
　　 在IL

25、-2誘導(dǎo)的T細胞中，BD926也可阻斷JAK3/STAT5信號通路抑制T細胞增殖。在JAK/STAT信號通路中，傳遞信號的分子依次為細胞因子受體亞基、JAK與STAT。細胞因子受體亞基包括α、β、γ鏈與gp130等分子。JAK家族由JAK1、JAK2、JAK3與TYK2四個分子組成。參與信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的STAT包括STAT1-6。不同的細胞因子需要借助不同的細胞因子受體亞基、JAK與STAT向細胞內(nèi)傳遞信號。
　　 Th1/Th2極化

26、與Th17/Treg失衡是導(dǎo)致自身免疫性炎癥的關(guān)鍵。JAK/STAT信號通路參與多種炎性細胞因子的應(yīng)答，調(diào)控Th1/Th2極化并調(diào)節(jié)Th17/Treg平衡。作為潛在的JAK/STAT號通路抑制劑，細胞因子篩查顯示BD926不影響IL-2(F=0.099,P=0.769, n=3)、IL-4(F=0.009, P=0.928, n=3)與IL-10（F=0.122，P=0.744，n=3）分泌，但顯著抑制IFN-γ(F=645.092，P

27、=1.427×10-5，n=3)、IL-6(F=845.594,P=8.326×10-6, n=3)與IL-17(F=256.913, P=8.859×10-5,n=3)產(chǎn)生。IL-12誘導(dǎo)CD4+T細胞分化為Th1，產(chǎn)生IFN-γ。IL-4誘導(dǎo)CD4+T細胞分化為Th2，抑制Th1分化。BD926不影響IL-4分泌，但抑制IFN-γ產(chǎn)生，提示BD926可能通過抑制Th1分化，調(diào)控Th1/Th2極化。IL-6是誘導(dǎo)CD4+T細胞分化為T

28、h17的重要細胞因子，Th17分化增殖后可產(chǎn)生IL-17A、IL-17F、IL-21與IL-22等炎癥細胞因子參與皮膚炎癥。IL-2/TGF-β誘導(dǎo)CD4+CD25+T細胞分化為Treg，Treg可分泌IL-10等抗炎因子抑制炎癥反應(yīng)。RAPA與CP-690，550不影響IL-2分泌及CD25表達，具有促進Treg產(chǎn)生或保持Treg功能的效應(yīng)。BD926不影響IL-2與IL-10分泌，但抑制IL-6及IL-17產(chǎn)生，提示BD926可能抑

29、制Th17分化，促進Treg產(chǎn)生，進而調(diào)節(jié)Th17/Treg平衡。
　　 綜上所述，我們合成了一組新型苯并噻唑類衍生物，其中BD750可通過阻斷JAK3/STAT5信號通路，完全抑制T細胞增殖。但BD750不溶于水，導(dǎo)致其體內(nèi)免疫抑制活性不顯著且不穩(wěn)定，這將限制進一步對其的研究與開發(fā)。我們隨后合成BD750的水溶性衍生物BD926。它不僅體外免疫抑制活性與BD750相當(dāng)，而且具有顯著的體內(nèi)免疫抑制活性。細胞因子篩查顯示BD926

30、不影響IL-2、IL-4與IL-10分泌，但顯著抑制IFN-γ、IL-6與IL-17產(chǎn)生，提示BD926可能調(diào)控Th1/Th2極化并調(diào)節(jié)Th17/Treg平衡，可有效控制自身免疫性炎癥。這類新型苯并噻唑類衍生物的結(jié)構(gòu)完全不同于臨床使用的免疫抑制劑，也不同于尚處臨床試驗階段的新型化合物。按照結(jié)構(gòu)生物學(xué)的原理，結(jié)構(gòu)決定靶點與功能。它們可能作用于已知的信號通路和靶細胞，但也可能作用于新的靶點。因此，這類新型苯并噻唑類衍生物的發(fā)現(xiàn)不僅可作為分子