CD59配體肽基因真核表達(dá)體系的構(gòu)建及對(duì)前列腺癌PC-3細(xì)胞活性的作用研究.pdf

1、CD59配體肽基因真核表達(dá)體系的構(gòu)建及對(duì)前列腺癌PC3細(xì)胞活性的作用研究摘要目的構(gòu)建CD59分子配體肽(sp22)基因真核表達(dá)重組體系，探討sp22基因?qū)?xì)胞CD59分子表達(dá)及功能的影響，為進(jìn)～步研究sp22分子與CD59分子的作用機(jī)制及利用短肽封閉CD59分子表達(dá)，為腫瘤基因靶向治療開辟新途徑。方法構(gòu)建含特異性sp22基因的真核重組表達(dá)載體sp—pIRES，脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染人前列腺癌PC一3細(xì)胞，G418篩選建立穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞系，RT—PC

2、R檢測(cè)轉(zhuǎn)染細(xì)胞中sp22基因mRNA的表達(dá)并篩選陽(yáng)性細(xì)胞克隆，RT—PCR檢測(cè)轉(zhuǎn)染細(xì)胞表面CD59mRNA表達(dá)量的變化，WesternBlot、ELISA競(jìng)爭(zhēng)抑制試驗(yàn)檢測(cè)轉(zhuǎn)染細(xì)胞CD59蛋白的表達(dá)；制備抗CD59多克隆抗體，臺(tái)盼藍(lán)染色試驗(yàn)和LDH試驗(yàn)檢測(cè)sp22分子對(duì)CD59分子功能的影響，MTT法測(cè)定PC一3細(xì)胞增殖抑制率。結(jié)果PCR、雙酶切及DNA測(cè)序鑒定表明成功構(gòu)建了sp—PIRES真核重組表達(dá)載體；RT—PCR試驗(yàn)證實(shí)sp22在

3、spPC一3細(xì)胞中成功表達(dá)；WesternBlot、ELESA競(jìng)爭(zhēng)抑制試驗(yàn)表明：spPC一3細(xì)胞比正常PC一3細(xì)胞CD59蛋白表達(dá)量減少，二者比較其差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(PO05)；與J下常PC一3細(xì)胞相比，補(bǔ)體對(duì)spPC3細(xì)胞的溶解殺傷能力明顯增強(qiáng)，二者比較其差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(PO05)；MTT結(jié)果測(cè)定spPC一3細(xì)胞與正常PC一3細(xì)胞相比較細(xì)胞增殖抑制率增高，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(PO05)。結(jié)論sp22基因可在mRNA及蛋白水平抑制人前列

4、腺癌PC一3細(xì)胞表面CD59蛋白分子的表達(dá)及功能，降低CD59分子抗補(bǔ)體活性，為進(jìn)一步研究利用SP22阻斷CD59分子在腫瘤細(xì)胞上的表達(dá)創(chuàng)造了有利條件，為腫瘤的免疫治療研究奠定基礎(chǔ)。碩士研究生李偉偉(免疫學(xué))指導(dǎo)教師高美華教授關(guān)鍵詞：配體；CD59；真核表達(dá)；PC3細(xì)胞；補(bǔ)體目錄第一章材料和方法411材料4111主要儀器設(shè)備4112質(zhì)粒、菌株與細(xì)胞株4113主要試驗(yàn)試劑412方法5121sp—pIRES重組表達(dá)載體的構(gòu)建及鑒定51211

5、sp22基因序列的選擇與設(shè)計(jì)51212引物設(shè)計(jì)51213sp—dsDNA的制備一61214sp一18T重組克隆載體的構(gòu)建及鑒定61215sp—pIRES重組表達(dá)載體的構(gòu)建及鑒定9122PC一3細(xì)胞的轉(zhuǎn)染及穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞克隆的篩選111221PC3細(xì)胞的培養(yǎng)111222PC3細(xì)胞的轉(zhuǎn)染”111223穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞克隆的建立121224PC3細(xì)胞內(nèi)總RNA提取121225sp22RT—PCRmRNA水平篩選陽(yáng)性細(xì)胞克隆131226轉(zhuǎn)染細(xì)胞CD5