CD59基因siRNA表達(dá)載體的構(gòu)建及CD59短肽封條對(duì)HeLa細(xì)胞凋亡作用的研究.pdf

1、目的：構(gòu)建針對(duì)CD59基因的pSUPER retro RNAi逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，為下一步研究腫瘤細(xì)胞內(nèi)CD59 RNAi奠定基礎(chǔ)。利用本課題組設(shè)計(jì)并合成的CD59短肽封條，檢測其對(duì)HeLa細(xì)胞凋亡的作用，為腫瘤的治療提供一條新的思路。 方法：根據(jù)GenBank提供的CD59基因mRNA的序列及siRNA的設(shè)計(jì)原則設(shè)計(jì)RNA干擾序列及一條對(duì)照序列，以CD59基因mRNA序列的220-238nt的19個(gè)bp片段作為靶序列，設(shè)計(jì)并合成兩

2、端含有酶切位點(diǎn)的60個(gè)堿基的寡核苷酸鏈。寡核苷酸鏈退火后用T4連接酶連接至線性化的質(zhì)粒pSUPER.retro.neo+GFP中，轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109，提取質(zhì)粒。然后通過酶切，PCR，測序鑒定重組質(zhì)粒。50mg/L CD59短肽封條作用于HeLa細(xì)胞24h后，用透射電鏡檢測HeLa細(xì)胞的凋亡情況；用MTT的方法來檢測HeLa細(xì)胞增殖抑制率；利用免疫組織化學(xué)方法檢測survivin，caspase-3，bax的表達(dá)水平。 結(jié)果：

3、經(jīng)酶切鑒定，PCR鑒定及測序結(jié)果表明成功地構(gòu)建了CD59基因的pSUPER retroRNAi逆轉(zhuǎn)錄病毒載體。透射電鏡結(jié)果表明，CD59短肽封條能使HeLa細(xì)胞的胞核發(fā)生碎裂。MTT實(shí)驗(yàn)表明轉(zhuǎn)CD59基因的HeLa細(xì)胞+短肽的細(xì)胞組增殖抑制率大于HeLa細(xì)胞+短肽組(P<0.01)。免疫組化實(shí)驗(yàn)顯示，轉(zhuǎn)CD59基因的HeLa細(xì)胞+短肽組和正常的HeLa細(xì)胞+短肽組相比較，survivin表達(dá)水平降低，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；而

4、caspase-3表達(dá)水平增高，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；bax的表達(dá)量各組比較(P>0.05)，差別無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 結(jié)論：酶切，PCR，測序鑒定成功地構(gòu)建了CD59基因的pSUPER retro RNAi逆轉(zhuǎn)錄病毒載體。電鏡，MTT實(shí)驗(yàn)及免疫組化實(shí)驗(yàn)顯示，CD59特異位點(diǎn)的短肽封條具有下調(diào)survivin的表達(dá)，活化caspase-3，從而促進(jìn)HeLa細(xì)胞的凋亡。我們的研究為CD59對(duì)腫瘤細(xì)胞凋亡信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的進(jìn)一步研究奠