核轉(zhuǎn)錄因子HMBOX1對肝癌細胞生物學特征的調(diào)節(jié)機制研究.pdf

1、目的
　　 肝癌是指發(fā)病于肝臟的惡性腫瘤，包括原發(fā)性和繼發(fā)性兩種。中國是原發(fā)性肝癌的高發(fā)區(qū)，每年死于肝癌的患者人數(shù)占全世界總數(shù)的一半以上。肝癌的常規(guī)治療手段主要包括手術(shù)、射頻消融和放化療等，生物治療是近些年來新興的治療方法，為那些無法或不愿接受常規(guī)治療的患者提供了一個新選擇。
　　 肝癌患者的愈后復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致其難以被徹底治愈的根本原因，研究發(fā)現(xiàn)，患者體內(nèi)殘存的腫瘤干細胞可能在此過程中起到了關(guān)鍵作用。在肝癌組織中，CD

2、133陽性的細胞擁有比其它細胞更強的腫瘤惡性表型，被認為是肝癌干細胞的表面標志，因此若能在治療腫瘤干細胞方面取得突破性的進展，必將具有重要的理論價值和社會意義。
　　 HMBOX1是2006年從人胰腺cDNA文庫中分離出來的新基因，屬于Homeobox家族，最近又發(fā)現(xiàn)了它的一個剪接變體HMBOX1b。研究發(fā)現(xiàn)，HMBOX1是一種潛在的核轉(zhuǎn)錄因子，發(fā)揮轉(zhuǎn)錄抑制活性。關(guān)于HMBOX1功能的研究很少，集中在其對NK細胞功能及骨髓基質(zhì)細

3、胞向血管內(nèi)皮細胞分化的調(diào)控作用，但具體的分子機制仍不清楚。以往的研究證實，HMBOX1同基因簇基因HNF-1α具有抗腫瘤活性，但有關(guān)HMBOX1與腫瘤關(guān)系的研究仍未有報道。
　　 本研究中，我們試圖通過構(gòu)建HMBOX1/HMBOX1b過表達載體，來研究HMBOX1與肝癌細胞系HepG2腫瘤生物學特征之間的關(guān)系，期望尋找到一種新的肝癌生物治療方法。
　　 方法
　　 1.免疫組化檢測臨床標本HMBOX1表達水平;<

4、br>　　 2.PCR和WesternBlot檢測多種腫瘤細胞系HMBOX1的mRNA水平和蛋白水平;
　　 3.利用分子生物學方法構(gòu)建HMBOX1/HMBOX1b與EGFP融合表達的真核表達載體;
　　 4.免疫熒光技術(shù)研究HMBOX1/HMBOX1b的亞細胞定位特征;
　　 5.CCK-8和流式細胞技術(shù)檢測過表達HMBOX1的HepG2細胞的增殖能力以及細胞周期;
　　 6.PCR檢測過表達HMBO

5、X1的HepG2細胞腫瘤干細胞相關(guān)基因以及促炎基因的表達;
　　 7.MTT方法和流式細胞技術(shù)檢測過表達HMBOX1的HepG2細胞對NK細胞殺傷敏感性及殺傷相關(guān)分子表達;
　　 8.基因芯片技術(shù)分析HMBOX1可能參與調(diào)控的信號通路和細胞分子生物學功能。
　　 結(jié)果
　　 1.HMBOX1的表達水平與肝癌組織的分化程度存在正相關(guān)關(guān)系;
　　 2.HMBOX1在多種肝癌細胞系中存在低表達現(xiàn)象;

6、r>　　 3.成功構(gòu)建了pEGFP-N1-HMBOX1、pEGFP-N1-HMBOX1b真核過表達載體;
　　 4.HMBOX1的亞細胞定位存在不均一性，HMBOX1b與HMBOX1的亞細胞定位有所不同;
　　 5.過表達HMBOX1對HepG2細胞的增殖能力和細胞周期無明顯影響;
　　 6.過表達HMBOX1能下調(diào)HepG2細胞的腫瘤干細胞相關(guān)基因和促炎基因表達;
　　 7.過表達HMBOX1的Hep

7、G2細胞對NK細胞殺傷敏感性增強;
　　 8.HMBOX1可能參與了多條腫瘤和免疫相關(guān)信號通路的調(diào)控，可能與組織器官和細胞的發(fā)育分化有關(guān)。
　　 結(jié)論
　　 HMBOX1作為一種發(fā)揮轉(zhuǎn)錄抑制活性的轉(zhuǎn)錄因子，具有調(diào)節(jié)NK細胞功能和促進骨髓基質(zhì)細胞分化的作用，目前尚不清楚該基因與腫瘤之間是否存在一定的調(diào)控關(guān)系。本研究根據(jù)本課題組早期研究中觀察到的肝癌組織中HMBOX1的低表達現(xiàn)象，進一步通過臨床標本的檢測發(fā)現(xiàn)，HMB

8、OX1與腫瘤組織的分化程度呈正相關(guān)關(guān)系，并且HMBOX1在多種肝癌細胞系中的表達水平明顯低于正常肝細胞。據(jù)此我們推測，HMBOX1可能與肝癌的發(fā)生發(fā)展存在一定的關(guān)系。
　　 通過構(gòu)建EGFP融合的HMBOX1/HMBOX1b表達載體，研究了HMBOX1和HMBOX1b的亞細胞定位，發(fā)現(xiàn)HMBOX1在細胞內(nèi)的定位具有特殊性，其剪接變體HMBOX1b的細胞定位與HMBOX1有所不同。通過對HMBOX1過表達的肝癌細胞系HepG2研究

9、發(fā)現(xiàn)，HMBOX1能下調(diào)HepG2細胞腫瘤干細胞相關(guān)基因和促炎基因的表達，而其剪接變體HMBOX1b則未表現(xiàn)出類似的活性。HMBOX1可能參與了腫瘤和免疫相關(guān)信號通路調(diào)控，并可能對組織器官和細胞的發(fā)育分化有一定的調(diào)控作用;同時HMBOX1能增強HepG2對NK的殺傷敏感性，發(fā)揮抗腫瘤效應(yīng)。
　　 本研究首次發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄因子HMBOX1與肝癌之間的調(diào)控關(guān)系，初步探討了其抗肝癌作用，但具體的調(diào)控機制有待進一步研究。為肝癌的治療、診斷預(yù)后