新型轉(zhuǎn)錄因子人HMBOX1的原核表達、單克隆抗體的制備及其功能的初步研究.pdf

1、研究目的：
　　 本課題涉及一種新的功能性基因-HMBOX1的研究。HMBOX1屬于Homeobox家族成員，其蛋白N端帶有homeobox結(jié)構域，C端帶有DNA結(jié)合結(jié)構域。到目前為止，HMBOX1已發(fā)現(xiàn)兩種異構體，HMBOX1和HMBOX1b(缺失Homeobox結(jié)構域)。HMBOX1基因在不同種屬中具有高度保守性，在人類可表達于18種組織中，其中在胰腺、腦、肝臟、腎臟等組織中高表達，既可表達在細胞漿，也可表達于細胞核。HMB

2、OX1是一種潛在的轉(zhuǎn)錄抑制因子，本實驗室前期研究中發(fā)現(xiàn)HMBOX1基因?qū)ψ匀粴毎哂忻黠@的調(diào)控作用。對HMBOX1具體功能的研究，不僅可以揭示這個新基因的功能，而且可以為進一步了解NK細胞發(fā)育和功能調(diào)節(jié)過程奠定基礎。
　　 新型轉(zhuǎn)錄因子的研究，特別是轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控和相互作用的研究離不開高特異性的抗體。本研究擬通過原核表達系統(tǒng)表達HMBOX1重組蛋白并制備其單克隆抗體，然后利用高特異性抗體研究HMBOX1的特征和功能。
　

3、　 1.首先構建HMBOX1原核表達載體，然后通過原核表達系統(tǒng)獲得重組融合蛋白。
　　 2.原核蛋白常以包涵體形式存在，所以對重組蛋白進行了純化和復性條件優(yōu)化。
　　 3.以具有天然構象的重組蛋白為抗原，通過雜交瘤技術制備單克隆抗體。
　　 4.確定單克隆抗體的特征并驗證單抗的特異性。
　　 5.鑒定單克隆抗體的應用范圍。
　　 6.應用制備的單抗研究HMBOX1在人體組織中的表達并初步研究其功

4、能。
　　 研究方法：
　　 1.PCR及RT-PCR構建原核重組表達載體pET22b-HMBOX1-6His。
　　 2.原核表達載體的誘導表達。
　　 1mM IPTG，37℃4h誘導E.coli Rosetta(DE3)菌株中HMBOX1重組蛋白的表達。
　　 3.Ni2+親和層析純化和復性重組HMBOX1蛋白
　　 利用重組蛋白6His標簽蛋白，Ni2+親和層析純化蛋白，并通過梯度

5、稀釋的尿素復性結(jié)合在固相凝膠上包涵體蛋白。
　　 4.制備酸處理裸菌
　　 以鼠傷寒桿菌為基礎經(jīng)稀醋酸處理得到裸菌，作為免疫佐劑。
　　 5.免疫接種動物和雜交瘤技術制備單克隆抗體。
　　 6.注射腹水大量制備單克隆抗體。
　　 7.ELISA和競爭性ELISA鑒定抗體的效價和親和力。
　　 8.SDS-PAG鑒定重組蛋白的表達。
　　 9.免疫標記技術檢測組織和細胞中HMBOX1

6、的表達。
　　 通過Western blot免疫印跡技術、免疫組化技術(細胞爬片，組織芯片)檢測細胞和組織中HMBOX1的表達情況；通過免疫熒光技術結(jié)合顯微鏡檢測HMBOX1的細胞定位；免疫熒光結(jié)合流式細胞儀檢測HMBOX1的胞內(nèi)表達。
　　 10.免疫共沉淀技術檢測單克隆抗體的應用并檢測肝細胞系中HMBOX1的表達。
　　 研究結(jié)果：
　　 1.重組HMBOX1蛋白的表達、純化和復性
　　 1.

7、1原核重組表達載體pET22b-HMBOX1-6His的構建
　　 首先，通過RT-PCR制備人自然殺傷細胞系NK-92細胞cDNA，利用HMBOX1特異性引物和高保真Ex Taq酶擴增得到人HMBOX1基因的蛋白編碼序列，通過測序驗證基因序列。然后以此為模板，重新設計引物得到改造的PCR擴增產(chǎn)物；PCR產(chǎn)物經(jīng)BamHⅠ和HindⅢ雙酶切后與載體pET22b連接，構建得到表達產(chǎn)物C端帶有信號肽引導序列和6×His標簽蛋白的pET

8、22b-HMBOX1表達載體。
　　 1.2重組蛋白的表達、純化和復性
　　 將構建的原核表達載體轉(zhuǎn)入E.coli Rosetta(DE3)菌株，此菌株能夠表達含有大量稀有堿基的人體蛋白。實驗表明，通過1mM IPTG誘導表達的重組蛋白以不可溶的包涵體形式存在。為獲得具備天然構象的HMBOX1，重組蛋白經(jīng)鎳親和層析技術同步純化和復性，復性采用濃度梯度降低的尿素灌流液流經(jīng)親和柱，使吸附在固相載體上的蛋白重新折疊，最后收集重

9、新折疊的重組HMBOX1蛋白。然后質(zhì)譜技術進行蛋白測序，驗證了復性HMBOX1蛋白的序列正確性。另外，非變性聚丙烯酰胺(SDS-PAGE)電泳證實，重組蛋白具備了天然構象并可形成二聚體，說明重組蛋白可能具有HMBOX1的天然構象。
　　 2.HMBOX1單克隆抗體的制備
　　 2.1單克隆抗體的制備
　　 以酸處理的鼠傷寒桿菌裸菌作為佐劑與復性重組HMBOX1蛋白一起免疫接種小鼠。蛋白質(zhì)抗原可以吸附在酸處理裸菌上

10、，表明可增強其誘導免疫應答的能力。當抗體效價達到一定程度時，應用雜交瘤技術，獲得兩株HMBOX1單克隆抗體雜交瘤細胞：2A5F4和4A4F2。
　　 2.2單克隆抗體的特征及應用研究
　　 免疫球蛋白類型鑒定證明：2A5F4株單抗為IgG2b/κ類型，4A4F2株單抗為IgM/κ類型。ELISA和競爭性ELISA試驗表明：純化的2A5F4株單抗的效價和親和力分別為1.024×10-5和3.67×108M-1；純化的4A4

11、F2株單抗的效價和親和力分別為5×10-5和3.35×108M-1。這兩株抗體具備較高的靈敏度并能特異性地和原核蛋白以及天然構象真核蛋白結(jié)合。經(jīng)免疫印跡和免疫組化分析驗證，4A4F2株抗體能檢測到HMBOX1在HEK-293T細胞中的表達變化，即在轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-HMBOX1的細胞中HMBOX1表達增加，在轉(zhuǎn)染siRNA/HMBOX1的細胞中HMBOX1表達降低。而2A5F4株單抗僅能應用于免疫組化技術的檢測。因此，這兩株單抗可與

12、具有天然構象的真核蛋白發(fā)生特異性結(jié)合并能應用于免疫印跡和免疫組化的檢測分析。另外，制備的單克隆抗體可應用于流式細胞術胞內(nèi)檢測和免疫共沉淀等多種免疫分析技術，為HMBOX1的體外作用機制研究提供了可靠的技術支持。尤其是2A5F4和4A4F2分別作為共沉淀抗體和免疫印跡抗體可以對肝臟細胞中的HMBOX1進行免疫共沉淀分析，為進一步HMBOX1的靶基因研究和蛋白質(zhì)相互作用研究提供了技術保障。
　　 3.人體組織中HMBOX1表達譜研究

13、及腫瘤表達差異性研究
　　 3.1細胞內(nèi)HMBOX1蛋白的定位和組織分布
　　 利用制備的高特異性單克隆抗體，通過免疫熒光技術研究HEK-293T細胞中HMBOX1的表達，發(fā)現(xiàn)HMBOX1蛋白同時表達于細胞漿和細胞核，這也表明HMBOX1發(fā)揮生理作用的可能機制為從細胞漿轉(zhuǎn)位到細胞核。
　　 以人體組織石蠟切片和組織芯片為研究對象，發(fā)現(xiàn)HMBOX1在多種人體組織中表達，特別在腎臟，大腦，甲狀腺，胃，腸，肝，胰腺，肺

14、，心臟肌肉，睪丸和前列腺等組織表達量較高。
　　 3.2 HMBOX1在人體正常組織和腫瘤組織中表達譜的差異
　　 HMBOX1可在多類型腫瘤組織中表達。與癌旁組織相比，在一些腫瘤中存在差異表達。肝癌組織中的HMBOX1蛋白水平比癌旁組織顯著性的減少；腎臟組織中的HMBOX1主要表達在腎小管，而在腎小球中表達很低，特別在腎小管來源的腎透明細胞癌腫高度表達；胰腺組織和腫瘤中都可見HMBOX1的高度表達，但未發(fā)現(xiàn)明顯差異。H

15、MBOX1在肝癌細胞中表達，這為進一步研究HMBOX1在肝癌的發(fā)生、發(fā)展過程中的作用提供了細胞研究模型。
　　 研究結(jié)論：
　　 1.成功構建了重組人HMBOX1原核表達載體pET22b-HMBOX1-6His。
　　 2.在E.coli Rosetta(DE3)誘導表達了重組HMBOX1蛋白，并利用His親和層析的方法對HMBOX1包涵體蛋白成功的進行了復性。復性蛋白具有HMBOX1的天然構象。
　　

16、3.制備了兩株特異性HMBOX1單克隆抗體：2A5F4和4A4F2。
　　 4.兩株單抗可特異性識別真核構象HMBOX1，并應用于western blot和免疫組化檢測。
　　 5.HMBOX1既可以表達在細胞漿也可以表達于細胞核。
　　 6.HMBOX1在多種組織中高表達，如肝臟、腎臟、胰腺和腦組織。
　　 7.HMBOX1在多種腫瘤組織中存在差異表達，特別是正常肝臟組織中的表達顯著高于肝癌組織中的表達

17、。
　　 8.肝細胞系HMBOX1的表達研究為闡明肝臟和肝癌中HMBOX1的功能提供了技術支持。
　　 研究意義
　　 本課題建立了一種HMBOX1原核蛋白表達、純化和復性的有效方案，并在此基礎上制備獲得兩株高特異性單克隆抗體。這兩株單克隆抗體可用于多種免疫檢測分析，為進一步研究HMBOX1的功能奠定了基礎。另外，HMBOX1作為一種轉(zhuǎn)錄因子，可能參與了腫瘤發(fā)生的具體機制，并可能對糖物質(zhì)代謝具有調(diào)控作用。所以，H